Giardia duodenum е паразитски организам кој предизвикува џардијаза, цревна инфекција особено честа кај малите деца со клинички знаци на дијареа.Претходно објавивме дека екстрацелуларниот G. duodenalis го активира активирањето на нуклеотидите кои врзуваат рецептор 3 (NLRP3) слични на интрацелуларната олигомеризација и ги регулира воспалителните реакции на домаќинот преку секрецијата на екстрацелуларните везикули (EV).Сепак, точните молекуларни обрасци на дуоденококниот EV (GEV) поврзан со патогенот вклучен во овој процес и улогата на инфламаторниот NLRP3 кај џардијазата останува да се разјаснат.
Рекомбинантните еукариотски експресивни плазмиди pcDNA3.1(+)-алфа-2 и алфа-7.3 џардини во GEV беа конструирани, трансфектирани во примарни перитонеални макрофаги на глувчето и откриени со мерење на целната молекула на воспалението каспаза-1.Нивото на изразување p20 беше прикажано..G. duodenalis алфа-2 и алфа-7.3 џардини првично беа идентификувани со мерење на инфламаторниот NLRP3 (NLRP3, про-интерлеукин-1 бета [IL-1β], про-каспаза-1 и каспаза-1 p20), секрецијата на IL.Нивоа на 1β, нивоа на олигомеризација на апоптотични точки протеин (ASC) и имунофлуоресцентна локализација на NLRP3 и ASC.Улогата на NLRP3 inflammasome во патогеноста на G. duodenalis потоа беше проценета со помош на глувци кај кои активирањето на NLRP3 беше блокирано (NLRP3 блокирани глувци) и беа следени патолошките промени во телесната тежина, дуоденалното паразитско оптоварување и дуоденалното ткиво.Дополнително, испитавме дали хиардините алфа-2 и алфа-7.3 индуцираат секреција на IL-1β in vivo преку инфламаторниот NLRP3 и ја утврдивме улогата на овие молекули во патогеноста на G. duodenalis кај глувците.
Алфа-2 и алфа-7,3 џардини ин витро индуцираат активирање на инфламаторниот NLRP3.Ова доведе до активирање на p20 каспаза-1, зголемување на нивоата на изразување на протеините NLRP3, про-IL-1β и про-каспаза-1, значително зголемување на секрецијата на IL-1β, формирање на дамки на ASA во цитоплазма и индукција на олигомеризација на ASA.Воспаление на NLRP3 Губењето на пенисот ја влошува патогеноста на G. duodenalis кај глувците.Глувците третирани со цисти од глувци блокирани со NLRP3 покажаа зголемен број на трофозоити и сериозно оштетување на дуоденалните ресички, карактеризирани со некротични крипти со намалени и разгранети.Ин виво експериментите покажаа дека џардини алфа-2 и алфа-7.3 можат да индуцираат секреција на IL-1β преку инфламаторниот NLRP3, а имунизацијата со џардини алфа-2 и алфа-7.3 ја намали патогеноста на G. duodenalis кај глувците.
Земени заедно, резултатите од оваа студија сугерираат дека џардија алфа-2 и алфа-7.3 предизвикуваат регулација на воспалението на домаќинот NLRP3 и ја намалуваат инфективноста на G. duodenalis кај глувците, кои се ветувачки цели за спречување на џардијазата.
Giardia duodenum е екстрацелуларен протозоански паразит кој живее во тенкото црево и предизвикува 280 милиони случаи на џардијаза со дијареа годишно, особено кај малите деца во земјите во развој [1].Луѓето се инфицираат со пиење вода или храна контаминирана со цисти на M. duodenum, кои потоа влегуваат во желудникот и се излачуваат во гастричниот сок.Трофозоитите на Giardia duodenum се прикачуваат на дуоденалниот епител, предизвикувајќи гадење, повраќање, дијареа, абдоминална болка и губење на тежината.Поединци со имунодефициенција и цистична фиброза се подложни на инфекции.Инфекцијата може да се појави и преку орален и анален секс [2].Лековите како што се метронидазол, тинидазол и нитазоксанид се претпочитани опции за третман за дуоденални инфекции [3].Сепак, овие лекови за хемотерапија предизвикуваат негативни несакани ефекти како што се гадење, канцерогенеза и генотоксичност [4].Затоа, треба да се развијат поефикасни стратегии за да се спречи инфекцијата со G. duodenalis.
Инфламазомите се класа на цитосолни протеински комплекси кои се дел од вродениот имунолошки одговор, помагајќи да се одбранат од инвазијата на патогенот и да посредуваат во воспалителните реакции [5].Помеѓу овие инфламазоми, нуклеотид-врзувачкиот олигомеризација (NOD) рецептор 3 (NLRP3) нуклеотид-врзувачки олигомеризација (NLRP3) воспаленија сличен на врзување со нуклеотиди е опширно проучен бидејќи може да се открие со различни патогени/молекуларни шеми поврзани со оштетување DAMP), препознава, го активира вродениот имунолошки систем.и ја регулира цревната хомеостаза кај многу воспалителни болести [6,7,8].Се состои од рецептор за препознавање на шаблони (PRR) NLRP3, адаптер апоптотички забележан протеин (ASC) и ефектор прокаспаза-1 или прокаспаза-11.Воспалителниот NLRP3 делува како домаќин против инвазијата на патогенот, како што е забележано во студиите за Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] и Leishmania.[11], но исто така е објавено дека активирањето на инфламаторниот NLRP3 ги ограничува заштитните имунолошки одговори и ја влошува прогресијата на болеста, на пример, кај црвите [12].Врз основа на нашите претходни наоди, известивме дека екстрацелуларниот G. duodenalis предизвикува интрацелуларна активација на воспалението на NLRP3 и ги модулира воспалителните одговори на домаќинот со лачење на екстрацелуларни везикули (EVs) [13].Сепак, улогата на NLRP3 inflammasome во инфекција со G. duodenalis in vivo останува да се утврди.
Џардините првично беа опишани како структурни компоненти на цитоскелетот G. duodenalis и играат важна улога во подвижноста на трофозоитите и прицврстувањето на епителните клетки во тенкото црево.За подобро да се прилагодат на околината и да ја зголемат нивната патогеност, трофозоитите на G. duodenalis развија единствена цитоскелетна структура која се состои од 8 флагели, 1 средно тело и 1 вентрален диск [14].Трофозоитите на Giardia duodenum го користат својот цитоскелет за да навлезат во горниот дел од тенкото црево, особено во дуоденумот и да се закачат за ентероцитите.Тие постојано мигрираат и се прикачуваат на епителните клетки користејќи го клеточниот метаболизам.Затоа, постои блиска врска помеѓу нивниот цитоскелет и вирулентноста.Џардините специфични за Giardia duodenum се компоненти на структурата на цитоскелетот [15] и се поделени во четири класи: α-, β-, γ- и δ-гиардини.Постојат 21 член на семејството α-гиардин, од кои сите имаат способност зависна од калциум да ги врзуваат фосфолипидите [16].Тие исто така го поврзуваат цитоскелетот со клеточната мембрана.Кај индивидуи со дијареа предизвикана од G. duodenalis, α-гиардините се високо изразени и имунореактивни за време на инфекцијата [17].Хетерологните вакцини базирани на Giardia alfa-1 штитат од џардијаза кај глувците и се потенцијални кандидати за антигени за развој на вакцината [18].Алфа-8 џардин, локализиран во плазматската мембрана и флагелите, но не и во вентралниот диск, ја подобрува подвижноста и стапката на раст на трофозоитите во G. duodenalis [19].Алфа-14 џардин се прикачува на микротубулските структури на флагелите и влијае на одржливоста на G. duodenalis [20].Алфа-11 џардин е присутен во изобилство во текот на животниот циклус, а прекумерната експресија на алфа-11 џардин го оштетува самиот G. duodenalis [21].Сепак, не е јасно дали алфа-2 џардин и алфа-7,3 џардин се заштитни од инфекција со G. duodenalis и нивните основни механизми.
Во оваа студија, рекомбинантните еукариотски експресивни плазмиди pcDNA3.1(+)-алфа-2 џардин и pcDNA3.1(+)-алфа-7.3 џардин беа трансфектирани во примарни перитонеални макрофаги на глувчето за да се активира NLRP3 на домаќинот.Потоа беа прегледани воспалителните цели.Ние, исто така, ја проценивме улогата на инфламозомот NLRP3 во патогеноста на G. duodenalis, истражувавме дали алфа-2 и алфа-7,3 џардини индуцираат активирање на инфламаторниот NLRP3 in vivo и утврдивме дека овие две улоги на џардини во патогеноста на G. duodenalis.Нашата заедничка цел беше да развиеме ветувачки цели за спречување на инфекцијата со G. duodenalis.
Дивиот тип (WT) C57BL/6 женски глувци на возраст од 5-8 недели беа купени од Центарот за експериментални животни Liaoning Changsheng (Лиаонинг, Кина).Глувците имаа слободен пристап до вода, добиваа стерилизирана храна и беа чувани во 12/12 часовен циклус светло/темно.Пред инфекцијата, глувците примале антибиотици ad libitum во вода за пиење дополнети со ампицилин (1 mg/mL), ванкомицин (1 mg/mL) и неомицин (1,4 mg/mL) (сите купени од Шангај, Кина, вештачки организми) [22 ].].Глувците кои ја изгубиле способноста да јадат и пијат > 24 часа и изгубиле ≥ 20% телесна тежина биле хумано еутанизирани со цервикална дислокација.
Трофозоитите на WB G. duodenalis (American Type Culture Collection, Manassas, USA) беа дополнети со 12,5% фетален говедски серум (FBS; Every Green, Жеџијанг, Кина) и 0,1% говедска жолчка (Sigma-Aldrich, St. Missouri, USA ).САД) под микроаеробни услови.Конфлуентните трофозоити беа собрани на мраз и преминаа во сооднос 1:4 за понатамошна репродукција.
Цистите на Giardia дуоденум беа индуцирани како што беше опишано претходно [23], трофозоитите беа собрани во логаритамска фаза и потоа разредени со медиум што предизвикува инкапсулација, pH 7,1 (модифициран TYI-S-33) до конечна концентрација од 1 × 106 трофозоити/mL.концентрација на жолчката 0,05% медиум).Трофозоитите беа култивирани под анаеробни услови на 37°C до фазата на логаритамски раст.Променете го медиумот во медиум што предизвикува цисти (pH 7,8; ​​модифициран TYI-S-33 медиум со 1% концентрација на жолчката) и култивирајте го G. duodenalis на 37°C за 48-96 часа, при што цистите на формирање беа набљудувани под микроскоп.Откако повеќето од трофозоитите беа индуцирани да формираат цисти, смесата од културата беше собрана и повторно суспендирана во стерилна дејонизирана вода за да се лизираат преостанатите трофозоити.Цистите беа изброени и складирани на 4°C за последователни анализи преку гастрична цевка кај глувци.
Екстрацелуларните везикули на Giardia (GEVs) беа збогатени како што беше опишано претходно [13].Трофозоитите во фазата на логаритамски раст беа повторно суспендирани во модифицирана TYI-S-33 средина подготвена со FBS осиромашена од егзозоми (Биолошки индустрии, Beit-Haemek, Израел) до конечна концентрација од 1 × 106 паразити/mL и инкубирани 12 часа.беа изолирани од супернатантот на културата со центрифугирање на 2000 g за 10 мин, 10,000 g за 45 мин, и 100,000 g за 60 мин.Талогите беа растворени во физиолошки раствор со фосфат пуфер (PBS), квантифицирани со помош на комплет за анализа на BCA протеин (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) и складирани на -80°C или директно се користат за понатамошни анализи.
Примарните перитонеални макрофаги на глувчето беа подготвени како што е опишано претходно [24].Накратко, на глувците (на возраст од 6-8 недели) им се инјектира (интраперитонеално [ip]) со 2,5 ml од 2,98% Difco течен тиогликолски медиум (BD, Franklin Lakes, NJ, САД) и хранети 3-4 непца.Суспензијата на макрофагите беше собрана од абдоминалната празнина на глувците по евтаназија и центрифугирана 3 пати на 1000 g за 10 мин.Собраните клетки беа детектирани со цитометрија на проток со користење на маркерот CD11b додека чистотата на клетките не беше >98%, потоа додадени на плочи за клеточна култура со 6 бунари (4,5 x 106 клетки/бунар) и инкубирани со 10% FBS (Биоиндустрија) на 37°C.и 5% CO2.
РНК беше извлечена од 1 × 107 трофозоити во 1 ml TRIzol реагенс (Vazyme, Нанџинг, Кина), геномската ДНК беше извлечена од вкупната РНК на G. duodenalis користејќи MonScript dsDNase (Monad, Вухан, Кина) и беше синтетизирана комплементарна ДНК (cDNA). користејќи MonScript RTIIII Super Mix (Monad) според упатствата на производителот.
Информациите за секвенцата на CDS за целниот ген G. duodenalis беа добиени од NCBI GenBank.Користете го Primer 5.0 за дизајнирање специфични прајмери ​​за беспрекорно клонирање за секој целен ген.Напредниот прајмер (5'-3') се состои од три дела: преклопувачка низа со линеаризиран вектор pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) и почетни кодони ATG и GNN (ако првата база не е G).Ова е направено за да се подобри ефикасноста на изразувањето.Дополнително, најмалку 16 bp комбинирани бази (содржина на GC 40–60%/Tm приближно 55 °C).Обратен прајмер (5'-3') се состои од два дела, секвенца што се преклопува со EcoRV-линеаризиран вектор pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) и комбинирана база од најмалку 16 bp.(со исклучок на последните две застанувања).бази) кодон како AA или GA за да им се овозможи на рекомбинантните плазмиди да ги изразат своите означени протеини).Прајмерните секвенци се наведени во Табела 1 и се синтетизирани од Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Чангчун, Кина).
Целите беа засилени со користење на Pfu DNA полимераза (Tiangen, Пекинг, Кина) или Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Пекинг, Кина) со користење на подготвена cDNA на G. duodenalis како шаблон.Еукариотскиот експресивен вектор плазмид pcDNA3.1(+) беше линеаризиран со рестриктивниот ензим EcoRV и дефосфорилиран со користење на Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Линеаризираните pcDNA3.1(+) фрагменти и засилените целни генски фрагменти беа прочистени со помош на комплет за прочистување на ДНК гел (Tiangen) и квантифицирани со помош на Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).Фрагментот pcDNA3.1(+) и секој целен генски фрагмент беа рекомбинирани со помош на MonClone единечна монтажна клонирана мешавина (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, Кина) и потврдени со секвенционирање на ДНК користејќи Comate Bioscience Company Limited (Чангчун, Кина)..
Плазмидите без ендотоксин pcDNA3.1(+)-алфа-2 и pcDNA3.1(+)-алфа-7.3 беа генерирани со користење на SanPrep-без ендотоксин плазмид мини комплет (Sangon Biotech).Концентрацијата се одржуваше над 500 ng/µl за да се осигури дека EDTA во пуферот за елуција не се меша со анализата на трансфекцијата.Примарните перитонеални макрофаги на глушец беа култивирани во плочи со 6 бунари со целосен медиум RPMI 1640 (Biological Industries) 12 часа, потоа клетките беа измиени 3 пати во топол PBS за да се отстранат пеницилинот и стрептомицинот, а потоа во медиум дополнет со целосен медиум.Плазмидите без ендотоксин pcDNA3.1(+)-алфа-2 и pcDNA3.1(+)-алфа-7.3 (2,5 μg) беа разредени во 125 μl Opti-MEM редуциран серумски медиум (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Потоа, 5 µl од трансфекцискиот реагенс Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) беше разреден во 125 µl ниско серумски Opti-MEM медиум.Подгответе липозоми-ДНК комплекси со мешање на разредениот плазмид без ендотоксин со Lipofectamine 2000 и оставете ја смесата да отстои на собна температура 5 минути.Префрлете ги комплексите одделно во клетките во секоја бунар и полека измешајте.По 4 часа, медиумот за клеточна култура беше заменет со 2 ml од целосен медиум RPMI 1640 и културата продолжи 24 часа.Свеж медиум за клеточна култура беше додаден во клетките и инкубиран за различни временски точки во зависност од дизајнот на анализата.
Протеинските примероци од супернатантите и клеточните лизати беа подготвени како што е опишано претходно [25].Параметрите за пренос на мембраната за про-IL-1β, про-каспаза-1, каспаза-1 p20, NLRP3, β-актин и Хис-ознака беа 200 mA/90 мин.За интерлеукин 1β (IL-1β; системи за истражување и развој, Минеаполис, Минесота, САД), каспаза-1 (p20) (Adipogen, Швајцарија) и NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Швајцарија) и 1:5000 насочена кон неговата ознака ( Amylet Scientific, Вухан, Кина) и β-актин (Proteintech, Вухан, Кина).
Вкрстено поврзување со дисукцинимид суберат (DSS) беше извршено како што беше опишано претходно [26].Клетките беа измиени 3 пати со ладен PBS и целосно лизирани со игла од 27 мерач во 50 µl ASC реакционен пуфер (pH 8,0) кој содржи 25 mM Na2PO4, 187,5 mM NaCl, 25 mM HEPES и 125 mM NaHCO3.Смесата беше центрифугирана на 5000 g за 3 мин и пелетот беше зашиен со 10 µl DSS (25 mM во DMSO) и 40 µl ASC реакционен пуфер за 30 мин на 37°C.По центрифугирање на 5000 g за 10 мин, пелетот беше растворен во раствор од 40 μl ASC реакционен пуфер и 10 μl 6x пуфер за полнење протеини (TransGen, Пекинг, Кина), а потоа растворот беше изгаснат на собна температура 15. мин., Потоа се вари 10 минути.Протеинските примероци потоа беа подложени на вестерн blotting користејќи примарни анти-ASC антитела (Wanleibio, Shenyang, Кина) во разредување сооднос од 1:500.
Следејќи ја претходно опишаната процедура [13], супернатантите од клеточната култура беа собрани и секрецијата на проинфламаторниот цитокин IL-1β беше одредена со помош на комплетот IL-1 Beta ELISA на глувчето (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Претворете ги вредностите на OD450nm во концентрации на протеини користејќи ја стандардната крива IL-1β.
Клетките обложени на покривки беа нежно измиени 3 пати во топол PBS, фиксирани во фиксатор на ткивни клетки (Biosharp, Пекинг, Кина) 10 минути на собна температура (RT), во 0,1% Triton X-Permeabilize на 100 (разреден во PBS; Biosharp ) 20 минути на собна температура и блокирање во 5% говедски серумски албумин (во PBS) 2 часа на собна температура.Клетките потоа беа инкубирани во текот на ноќта на 4°C со примарни антитела против ASC (разредување 1:100) или NLRP3 (разредување 1:100), соодветно, и Cy3 означени со IgG (H+L) од коза против зајак (H+L) (1:400; EarthOx). , Сан Франциско, Калифорнија, САД) или FITC-конјугиран коза против глувче IgG (1:400; Earthox) во текот на ноќта на 37°C во темница за 1 час.Јадрата беа обоени со Hoechst 33258 (10 μg/ml; UE, Сужоу, Кина) 5 минути и беа набљудувани под флуоресцентен микроскоп (Olympus Corporation, Токио, Јапонија).
Глувците беа поделени во четири групи (n = 7 во секоја група): (i) негативна контролна група третирана со PBS (само PBS; внесете 100 µl/PBS на глушец проследено со дневна интраперитонеална инјекција 100 µl/PBS на глушец 3 часа подоцна)., континуирано 7 дена);(ii) негативна контролна група третирана со MCC950 инхибитор [27] (100 μl/глувче преку PBS газа, 3 часа подоцна, 10 mg/kg телесна тежина [BW] MCC950 [во PBS] беше администриран интраперитонеално дневно, времетраење од 7 дена);(iii) Група за инфекција со цисти со G. duodenalis (1,5 x 106 цисти/глувче со гаважа, 3 часа подоцна, 100 μl/ПБС на глушец интраперитонеално администрирани дневно во тек на 7 дена);(iv) Група за третман со инхибитори на MCC950 со комбинирана циста на G. duodenalis (1,5 × 106 цисти/глувче преку диважа, 10 mg/kg телесна тежина MCC950 интраперитонеално дневно во тек на 7 дена на 3 часа).Телесната тежина на секој глушец беше следена секојдневно и сите глувци беа еутанизирани на 7-ми ден.Собраниот дуоденум (долг 3 cm) беше исечен на мали парчиња во 1 ml PBS, цистите беа уништени преку ноќ во PBS на 4°C и G. duodenalis трофозоити.Свеж дуоденум (долг 1 cm) беше изолиран за боење со хематоксилин и еозин (H&E).
Глувците беа поделени во две групи: (i) контролна група MOCK и (ii) група инхибитор на MCC950.Имаше пет третмани во секоја група (n = 7/група за третман): (i) негативна контролна група за третман со PBS (само PBS; 100 μl/PBS на глушец, интрамускулна (IM) инјекција (tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) pcDNA3.1(+) плазмидна негативна контролна група (100 μg/ДНК на глушец, преку интрамускулна инјекција) група третирана со плазмид pcDNA3.1(+)-алфа-2 (100 μg/ДНК на глушец, со интрамускулна инјекција) и (v) група третирана со плазмид pcDNA3.1(+)-алфа-7.3 (100 μg/глувче ДНК, по 12 часа поминување, глувците во групата со инхибитори на MCC950 добиваа дневна интраперитонеална инјекција на MCC950 (10 mg/kg телесна тежина) во тек на 7 дена, додека глувците во групата MOCK добија еднаков волумен на третман со PBS. Примероците од крв беа Собрани од глувците со очно јаболко и оставени преку ноќ на 4 °C Серумските примероци беа изолирани со помош на ензимски поврзана имуносорбентна анализа (ELISA) и мерење на нивоата на IL-1β.
Триесет и пет глувци беа поделени во пет групи (n=7/група).Групата 1 беше негативна контролна група третирана со PBS: глувците добија 100 μl PBS интрамускулно и 3 дена подоцна со гаважа.Групата 2 е позитивна контролна група инфицирана со цисти на G. duodenalis: на глувците им биле инјектирани 100 μl PBS, а 3 дена подоцна 1,5 x 106 цисти/глувче биле инјектирани интрагастрично.Трета група – плазмидна имунизација со pcDNA3.1(+) во комбинација со контролна група за инфекција со дуоденална циста: глувците примиле 100 μg плазмидна ДНК pcDNA3.1(+)(im) орално, 1,5×106 цисти/глувче 3 за неколку денови.Групите 4 и 5 беа рекомбинантен pcDNA3.1(+)-алфа-2 џардин плазмид или pcDNA3.1(+)-алфа-7.3 џардин плазмид во комбинација со G. duodenalis циста инфекција.Експериментална група: глувците добија 100 μg pcDNA3.1(+)-гиардин плазмидна ДНК (im), потоа 3 дена подоцна, 1,5 × 106 цисти/глувче беа инјектирани преку диважа.Телесната тежина на секој глушец беше следена по воведувањето на цистата G. duodenalis низ цевката.Свеж дуоденум беше собран за мерења на паразитското оптоварување и анализа на HE боење.
Хистопатолошките промени беа анализирани според претходно објавена процедура [30].Свеж дуоденум беше фиксиран со фиксатор на ткивни клетки, вграден во парафин, исечен на делови од 4 μm, обоен со H&E и анализиран под светлосен микроскоп.Репрезентативните патолошки промени во седум ткивни делови од седум независни глувци беа оценети од патолог кој не знаеше за третманот и беа снимени со 200x зголемување.Должината на ресичките и длабочината на криптите беа измерени во согласност со претходно опишаните методи.
Резултатите in vitro и in vivo беа добиени во три примероци.Графиконите беа генерирани со помош на GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, САД).Разликите помеѓу две групи беа анализирани со t-тест, додека разликите помеѓу ≥3 групи беа анализирани со еднонасочна анализа на варијанса (ANOVA) со користење на софтвер SPSS (верзија 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, САД).Податоците беа анализирани за хомогеност на варијансата со користење на Левеновиот тест проследен со Bonferroni-овиот пост хок тест (Б).Значењето е изразено како P<0,05, P<0,01 и P<0,001 (не значајно [ns]) (P>0,05).
Нашата претходна анализа на GEV протеомика во енциклопедија на гени и геноми од Кјото (KEGG) покажа дека многу цели може да бидат вклучени во активирањето на воспалителните сигнални патишта [13].Избравме две ветувачки цели, алфа-2 и алфа-7,3 џардини, ги засилуваме овие молекули и ги користиме за да го конструираме векторот на еукариотска експресија pcDNA3.1(+).По секвенционирањето, рекомбинантните pcDNA3.1(+)-алфа-2 и алфа-7.3 џардини експресивни плазмиди беа трансфектирани во примарни перитонеални макрофаги на глувчето, и беше идентификуван каспаза-1 p20 потписен протеин на воспаление (фрагмент од активирана каспаза-1). како осветлувачки клучни молекули кои можат да предизвикаат воспаление.Резултатите покажаа дека алфа-2 и алфа-7,3 џардини може да предизвикаат изразување на p20 каспаза-1 слично на GEV.Не беше пронајден ефект врз активирањето на каспаза-1 во нетретирана негативна контрола (само PBS) и контрола на плазмид pcDNA3.1 (+) (Слика 1).
Мерење на активирањето на p20 каспаза-1 со pcDNA3.1(+)-алфа-2 и алфа-7.3 џардини.Рекомбинантните еукариотски експресивни плазмиди pcDNA3.1(+)-алфа-2 и алфа-7.3 џардини (над секоја лента) беа трансфектирани во примарни перитонеални макрофаги на глувчето и супернатантите на културата беа собрани 24 часа подоцна.За мерење на нивоата на изразување на препознатливиот воспалителен протеин каспаза-1 p20 се користеше Western blotting.Групата за третман само со PBS (лента C) и групата за монотерапија со pcDNA3.1 (+) (pcDNA3.1 лента) беа користени како негативна контрола, а групата за третман со GEV беше користена како позитивна контрола.Изразувањето на рекомбинантниот протеин беше потврдено со откривање на ознака на хистидин во секој протеин, а очекуваните протеински ленти беа алфа-2 џардин (38,2 kDa) и алфа-7,3 џардин (37,2 kDa).GEV, екстрацелуларни везикули на Giardia дуоденум, pcDNA3.1(+), EcoRV-линеаризиран вектор, SUP, супернатант
За да се утврди дали алфа-2 џардин и алфа-7,3 џардин индуцираат изразување на p20 каспаза-1 и играат улога во активирањето на инфламаторниот одговор на домаќинот NLRP3, pcDNA3.1 (+)-алфа-2 џардин и pcDNA3.1 (+)-алфа -7.3 џардин беше трансфектиран во примарни перитонеални макрофаги на глувчето со рекомбинантна плазмидна ДНК и беа утврдени нивоата на експресија, локализација и олигомеризација на клучните воспалителни протеини NLRP3.Во овој експеримент, GEV беше користен како позитивна контролна група, а групата без третман (само PBS) или групата за третман на трансфекција pcDNA3.1 (+) беше негативна група.Резултатите покажаа дека, како и во групата GEV, рекомбинантната плазмидна ДНК на џардин pcDNA3.1(+)-алфа-2 и џардин pcDNA3.1(+)-алфа-7.3 резултираше со нагорна регулација на NLRP3, про-IL-1β и активирање на прокаспаза-1 и каспаза-1 (сл. 2а).Дополнително, двата џардини индуцираа значајна секреција на IL-1β (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.1000; алфа-2 џардин: ANOVA, F(4, 10) = 1.625, P = 0.0007 ).;алфа-7,3 џардин: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P<0,0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (Слика 2б).Повеќето ASC протеини беа мономерни во групата без третман или во групата со третман трансфицирани со pcDNA3.1 (+) плазмидот, за разлика од pcDNA3.1 (+)-алфа-2 или pcDNA3.1 (+)-алфа- 7,3 џардин.ASC олигомеризацијата се случи во рекомбинантната плазмидна ДНК на GEV позитивната контролна група или група, покажувајќи олигомерна форма (Слика 2в).Овие прелиминарни податоци сугерираат дека алфа-2 џардин и алфа-7,3 џардин може да предизвикаат активирање на воспалението на NLRP3.Последователните имунофлуоресцентни студии за локализацијата на ASC и NLRP3 покажаа дека во негативната контролна група, ASC протеинот беше расеан низ цитоплазмата и се појави како сигнал со точки при стимулација на pcDNA3.1(+)-алфа-2 со џардин или pcDNA3.1(+)-алфа-7,3 група џардин или GEV позитивна контролна група (Слика 2г).Во групите pcDNA 3.1, третирани со негативна контрола и плазмид, протеинскиот сигнал NLRP3 не беше откриен, додека флуоресцентна сигнална точка како одговор на pcDNA3.1(+)-алфа-2 џардин или pcDNA3.1(+)-алфа-7.3 беше откриен..џардин се наоѓаат во цитоплазмата или при стимулација на HEV (сл. 2д).Овие податоци дополнително покажуваат дека G. duodenalis џардин алфа-2 и џардин алфа-7.3 го активираат NLRP3 инфламазомот кај примарните перитонеални макрофаги на глувчето.
pcDNA3.1(+)-алфа-2 џардин и pcDNA3.1(+)-алфа-7.3 џардин го активираат NLRP3 инфламазомот кај перитонеалните макрофаги на глувчето.Трансфектирајте ги рекомбинантните плазмиди на еукариотска експресија pcDNA3.1(+)-алфа-2 џардин и pcDNA3.1(+)-алфа-7.3 џардин во примарни глувчешки перитонеални макрофаги и клетки, или берете го супернатантот во рок од 24 часа за анализа на изразување, олигомеризација , секрет.и локализација на клучните воспалителни протеини.Групата само PBS (C) и групата pcDNA3.1 (+) со единечен третман беа користени како негативна контрола, а групата за третман со GEV беше користена како позитивна група.a Клучните воспалителни протеини NLRP3, вклучувајќи NLRP3, про-IL-1β, про-каспаза-1 и p20 каспаза-1, беа откриени со вестерн blotting.b.Разликите помеѓу контролните и експерименталните групи беа анализирани со еднонасочна анализа на варијанса (ANOVA) со помош на софтверот SPSS верзија 22.0.Ѕвездичките укажуваат на значајни разлики помеѓу групите **P<0,01 и ***P<0,001.c Нивоата на олигомеризација на ASC во пелети беа одредени со DSS анализа на вкрстено поврзување, додека нивоата на ASC во клеточните лизати беа користени како контрола на вчитување.г Визуелизација на локализацијата на ISC користејќи имунофлуоресценција.e Имунофлуоресценција беше искористена за да се визуелизира локализацијата на NLRP3.ASC, апоптозен протеин сличен на дамки;IL, интерлеукин;NLRP3, нуклеотид-врзувачки рецептор сличен на олигомеризација 3;ns, не е значајно (P > 0,05)
И G. duodenalis и GEV што ги лачи го активираат NLRP3 инфламозомот и ги регулираат инфламаторните одговори на домаќинот ин витро.Така, улогата на NLRP3 inflammasome во патогеноста на G. duodenalis останува нејасна.За да го истражиме ова прашање, дизајниравме експеримент помеѓу глувци инфицирани со G. duodenalis циста и глувци инфицирани со G. duodenalis циста + третман со инхибитор MCC950 и го споредивме NLRP3 инфламаторниот израз кога се инфицирани со G. duodenalis циста.Детална шема на експериментот е прикажана на Сл. 3а.Промените во телесната тежина на глувците во различни групи на третман беа следени 7 дена по инфекцијата со цисти, а резултатите се прикажани на Сл. 3б.Во споредба со групата третирана со чист PBS, резултатите покажаа дека (i) телесната тежина на глувците инфицирани со G. duodenalis циста се намалила од 3 до 7 ден по инфекцијата;(ii) третманот со инхибиторот MCC950 немаше значаен ефект врз телесната тежина на глувците..Во споредба со групата со единечна инфекција, BW на групата со дуоденални инфекции третирани со MCC950 се намали на различни степени (ден 1: ANOVA, F(3, 24) = 1,885, P = 0,0148; Ден 2: ANOVA, F(3, 24 ) = 0,4602, P<0,0001; (3, 24)=0,6497, P=0,0645: ANOVA, F(3, 24)=5,457, P=0,0175: ANOVA, F(3, 24) = 2,893, P = 0,0202).Овие податоци покажуваат дека NLRP3 inflammasome ги штити глувците од значително губење на тежината во раните фази (2-4 дена) на дуоденална инфекција.Потоа имавме за цел да ги откриеме трофозоитите на G. duodenalis во течноста за дуоденална лаважа и резултатите се прикажани на Слика 3в.Во споредба со групата со инфекција со цисти со G. duodenalis, бројот на трофозоити во дуоденумот значително се зголемил по блокирањето на инфламаторниот NLRP3 (t(12) = 2.902, P = 0.0133).Дуоденалните ткива обоени со HE покажаа, во споредба со негативната контрола третирана само со PBS и MCC950: (i) G. duodenalis циста инфекција резултираше со оштетување на дуоденалните ресички (ANOVA, F(3, 24)=0,4903, P= 0,0488 ) и атрофија на криптата (АНОВА, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) дуоденум од глувци инфицирани со G. duodenalis цисти и третирани со MCC950 инхибитори.дуоденалните ресички беа оштетени и мртви (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0144) со атрофија и разгранување на криптата (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0, 0481) (Сл. 3d- ѓ) .Овие резултати сугерираат дека NLRP3 inflammasome игра улога во намалувањето на патогеноста на G. duodenalis.
Улогата на инфламаторниот NLRP3 во инфекција со Giardia дуоденум.Глувците беа газени (iv) со дуоденококни цисти и потоа третирани со или без MCC950 (ip).Како контроли беа користени групи за единечни третмани со PBS или MCC950.Експериментална група и режим на третман.б Телесната тежина на глувците во секоја од различните групи на третман беше следена 7 дена.Разликата помеѓу групата со инфекција со G. duodenalis и групата за третман на инфекција со G. duodenalis + MCC950 беше анализирана со t-тест користејќи SPSS софтвер верзија 22.0.Ѕвездичките покажуваат значителни разлики кај *P<0,05, **P<0,01 или ***P<0,001.в.Разликата помеѓу групата со инфекција со G. duodenalis и групата за третман на инфекција со G. duodenalis + MCC950 беше анализирана со t-тест користејќи SPSS софтвер верзија 22.0.Ѕвездичките покажуваат значителни разлики на *P <0,05.г Резултати од боење со хематоксилин и еозин (H&E) од дуоденална хистопатологија.Црвените стрелки укажуваат на оштетување на ресичките, зелените стрелки укажуваат на оштетување на криптите.Лента за скала: 100 µm.e, f Статистичка анализа на висината на дуоденалните ресички и висината на криптата на глувчето.Ѕвездичките покажуваат значителни разлики кај *P<0,05 и **P<0,01.Резултатите се земени од 7 независни биолошки експерименти.BW, телесна тежина;иг, интрагастричен пат на испорака;ip, интраперитонеален пат на испорака;ns, не е значајно (P > 0,05);PBS, солен раствор со фосфат пуфер;WT, див тип
Секрецијата на IL-1β е белег на активирањето на воспалението.За да одредиме дали G. duodenalis алфа-2 џардин и алфа-7.3 џардин го активираат инфламаторниот NLRP3 домаќин in vivo, користевме нетретирани WT глувци (шам група) и NLRP3-блокирани со инфламаторни глувци (група за третман инхибирана со MCC950).Детална шема на експериментот е прикажана на Сл. 4а.Експерименталните групи се состоеја од глувци третирани со PBS, третман на циста G. duodenalis со гаважа, интрамускулна инјекција на pcDNA3.1 и интрамускулна инјекција на pcDNA3.1(+)-алфа-2 џардин или pcDNA3.1-алфа-7.3 џардин.На 7-миот ден по интрамускулна администрација на рекомбинантниот плазмид, беше собран серумот и беше одредено нивото на IL-1β во секоја група.Како што е прикажано на Слика 4б, во групата MOCK: (i) во споредба со групата PBS, третманот со pcDNA3.1 немал значаен ефект врз секрецијата на IL-1β (ANOVA, F(4.29)=4.062, P=0.9998), сепак, Секрецијата на IL-β беше значително покачена во групата на цисти на G. duodenalis (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0002), (ii) pcDNA3.1-алфа-2 џардин и pcDNA3.1- Интрамускулна инјекција на алфа-7,3 џардин значително ги зголеми нивоата на серумскиот IL-1β (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P<0,0001);(iii) pcDNA3.1-алфа-7,3 џардин индуциран високи нивоа на секреција на IL-1β во групата за интрамускулна инјекција на pcDNA3.1-алфа-2 џардин (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0333) .Во споредба со секоја група во групата за третман со MCC950 и групата MOCK: (i) нивоата на секреција на IL-1β во контролната група PBS и контролната група pcDNA3.1 се намалија до одреден степен по блокирањето на инхибиторот MCC950, но разликата не беше значајни (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.4912 pcDNA3.1: ANOVA, F(9, 58) = 3.540, P = 0.5949);(ii) по блокирањето на MCC950., секрецијата на IL-1β беше значително намалена во групата заразена со циста G. duodenalis, групата pcDNA3.1-алфа-2 џардин и pcDNA3.1-алфа-7.3 групата џардин (G. duodenalis: ANOVA, F(9 , 58) = 3,540, P = 0,0120 pcDNA3,1-алфа-2 џардин: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,0447 pcDNA3,1-алфа-7,3 џардин: ANOVA, F(; ) = 3,540, P = 0,0164).Овие резултати сугерираат дека алфа-2 џардин и алфа-7,3 џардин посредуваат во активирањето на инфламаторниот NLRP3 in vivo.
pcDNA3.1(+)-гиардините го активираат NLRP3-домаќинот инфламозом in vivo.Глувците беа имунизирани (IM) со рекомбинантна еукариотска експресивна плазмида pcDNA3.1(+)-алфа-2 џардин или pcDNA3.1(+)-алфа-7.3 џардин и потоа третирани со MCC950 (ip; MCC950 група) или не (лажна група ).Групата за третман со плазмид со PBS или pcDNA3.1(+) беше користена како негативна контрола, а групата за третман на циста G. duodenalis беше користена како позитивна контрола.Експериментална група и режим на третман.b Серумските нивоа на IL-1β кај глувците беа измерени на 7-ми ден со ELISA анализа.Разликите меѓу групите во групата MOCK беа анализирани со користење на еднонасочна ANOVA, а разликите помеѓу групата MOCK и групата MCC950 беа анализирани со користење на t-тестот на SPSS софтверот верзија 22.0.Ѕвездичките укажуваат на значајни разлики помеѓу групите за третман во групата MOCK, *P<0,05 и ***P<0,001;Знаците за долар ($) укажуваат на значајни разлики помеѓу секоја група во групата MOCK и групата MCC950 на P<0,05.Резултати од седум независни биолошки експерименти.i, интрамускулна инјекција, ns, незначително (P > 0,05)
За да го истражиме ефектот на алфа-2 и алфа-7.3 посредувано од џардин активирањето на инфламазомот на домаќинот NLRP3 врз инфективноста на G. duodenalis, користевме WT C57BL/6 глувци и инјектиравме алфа-2 џардин и алфа-7.3 џардин.плазмидот бил инјектиран интрамускулно, по 3 дена низ гастричната цевка на цистата G. duodenalis, по што глувците биле набљудувани 7 дена.Детална шема на експериментот е прикажана на Сл. 5а.Телесната тежина на секој глушец се мереше секој ден, примероци од свежо дуоденално ткиво беа собрани на 7-ми ден по администрацијата преку гастрична цевка, беше измерен бројот на трофозоити и беа забележани хистопатолошки промени.Како што е прикажано на слика 5б, со зголемување на времето на хранење, BW на глувците во секоја група постепено се зголемува.МТ на глувците почна да се намалува на третиот ден по интрагастрична администрација на цисти G. duodenalis, а потоа постепено се зголемуваше.Активирањето на инфламаторниот NLRP3 индуциран со интрамускулна инјекција на алфа-2 џардин и алфа7,3 џардин значително го атенуира губењето на тежината кај глувците (1 ден: pcDNA3.1-алфа-2 џардин, ANOVA, F(4, 30) = 1.399, P = 0,9754 Ден 1: pcDNA3.1-алфа-7.3 џардин, ANOVA, F(4, 30)=1.399, P=0.9987 Ден 2: pcDNA3.1-алфа-2 џардин, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,9979 Ден 2: pcDNA3,1-алфа-7,3 џардин, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,8409 Ден 3: pcDNA3,1-алфа-2, ANOVA; 4; , F(4, 30) = 0,5620, P = 0,0012, ден 4: pcDNA3,1-алфа-7,3 џардин, ANOVA, F(4, 30) = 0,5620, P <0,0001, ден 5: pcDNA3,1-алфа - 2 џардин, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Ден 5: pcDNA3,1-алфа -7,3 џардин, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Ден 6: 1 pcDNA3. алфа-2 џардин, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, Ден 6: pcDNA3,1-алфа-7,3 џардин, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0006;Ден 7: pcDNA3.1-алфа-2 џардин, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P<0.0001 Ден 7: pcDNA3.1-алфа-7.3 џардин, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P <0,0001).Паразитското оптоварување беше проценето во дуоденумот (сл. 5в).Во споредба со нетретираната позитивна контрола и групата инјектирана со празен вектор pcDNA3.1, бројот на трофозоити на G. duodenalis беше значително намален во групите инјектирани со α-2 џардин и α-7,3 џардин (pcDNA3.1-алфа -2 џардин: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0002, pcDNA3,1-алфа-7,3 џардин: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P<0,0001).Дополнително, џардин алфа-7.3 бил позаштитен кај глувците отколку џардин алфа-2 (АНОВА, F(3, 24) = 1.209, P = 0.0081).Резултатите од HE боењето се прикажани на сл.5d–f.Глувците инјектирани со алфа-2 џардин и алфа-7,3 џардин имале помалку лезии на дуоденалното ткиво, манифестирани со оштетување на ресичките, во споредба со глувците инјектирани со G. duodenalis и глувците инјектирани со G. duodenalis во комбинација со празен pcDNA3 вектор .1 Зум.(pcDNA3.1-алфа-2 џардин: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0035 или P = 0.0068; pcDNA3.1-алфа-7.3 џардин: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0,0028 или P = 0,0055) и намалена атрофија на криптата (pcDNA3.1-алфа-2 џардин: ANOVA, F(3, 24) = 1,470, P = 0,0264 или P = 0,0158; pcDNA3,1-алфа-2АВА-7. , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 или P = 0,0191).Овие резултати сугерираат дека алфа-2 џардин и алфа-7,3 џардин ја намалуваат инфективноста на G. duodenalis со активирање на инфламаторниот NLRP3 in vivo.
Улогата на pcDNA3.1(+)-џардини во инфекција со G. duodenalis.Глувците беа имунизирани (IM) со рекомбинантни плазмиди на еукариотска експресија pcDNA3.1(+)-алфа-2 џардин или pcDNA3.1(+)-алфа-7.3 џардин и потоа предизвикани со G. duodenalis цисти (ig).Групата PBS и групата за третман на цисти со pcDNA3.1(+) + дуоденални цисти беа користени како негативни контролни групи, а групата за третман на дуоденални цисти беше користена како позитивна контролна група.Експериментална група и режим на третман.б МТ на глувците во секоја од различните групи на третман беше следена 7 дена по предизвикот.Ѕвездичките укажуваат на значајни разлики помеѓу групите во групата G. duodenalis и групата pcDNA3.1(+)-алфа-2 џардин, *P <0.05, **P <0.01 и ***P <0.001;знакот за долар ($) укажува на значајна разлика помеѓу секоја група на G. duodenalis и групата pcDNA3.1(+)-алфа-7.3 жардини, $$P<0.01 и $$$P<0.001.в.Разликите помеѓу групата со инфекција со G. duodenalis, групата pcDNA3.1(+)-алфа-2 џардин и pcDNA3.1(+)-алфа-7.3 групата беа анализирани со еднонасочна ANOVA користејќи SPSS верзија 22.0.Ѕвездичките покажуваат значителни разлики кај **P<0,01 и ***P<0,001.г Хистопатолошки промени во дуоденумот.Црвените стрелки укажуваат на оштетување на ресичките, зелените стрелки укажуваат на оштетување на криптите.Лента за скала: 100 µm.e, f Статистичка анализа на висината на дуоденалните ресички на глувчето (д) и висината на криптата (f).Разликите помеѓу групите на Слика 1г беа анализирани со еднонасочна ANOVA користејќи SPSS софтвер верзија 22.0.Ѕвездичките покажуваат значителни разлики кај *P<0,05 и **P<0,01.Резултати од седум независни биолошки експерименти.ns, не е значајно (P > 0,05)
Giardia duodenum е добро познат интестинален паразит на луѓето и другите цицачи кој предизвикува џардијаза.Во 2004 година, тој беше вклучен во Иницијативата за занемарени болести на СЗО поради неговата висока преваленца во текот на 6 години, особено во заедниците со низок социо-економски статус [32].Вродениот имунолошки систем игра клучна улога во имунолошкиот одговор на инфекцијата со G. duodenalis.Пријавено е дека макрофагите на глувците го голтаат и убиваат G. duodenalis со ослободување на екстрацелуларни стапици [33].Нашите претходни студии покажаа дека G. duodenalis, неинвазивен екстрацелуларен паразит, ги активира p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 и NLRP3 воспалителните сигнални патишта кај макрофагите на глувците за да ги регулира воспалителните реакции на домаќинот, а ослободениот GEV може да го подобри овој процес.13], 24].Сепак, точните PAMPs вклучени во воспалението регулирано со NLRP3 во GEV и улогата на NLRP3 воспалението кај џардијазата останува да се разјаснат.За да ги расветлиме овие две прашања, ја спроведовме оваа студија.
NLRP3 inflammasome се наоѓа во цитоплазмата на имуните клетки и може да се активира од различни честички како што се кристали на урична киселина, токсини, бактерии, вируси и паразити.Во бактериски студии, токсините се идентификувани како клучни PAMPs кои ги активираат воспалителните сензори, што доведува до воспаление и клеточна смрт [34].Некои структурно различни токсини, како што се хемолизин од Staphylococcus aureus [35] и Escherichia coli [36], хемолизин BL (HBL) од ентеротоксин (NHE) [37], предизвикуваат активирање на воспалението на NLRP3.Вирусни студии покажаа дека вирулентните протеини како што се протеинот SARS-COV-2 обвивка (E) [38] и Зика вирусот NS5 протеин [39] се важни PAMPs препознаени од NLRP3 рецепторот.Во студиите за паразити, многу паразити се пријавени дека се поврзани со активирање на инфламаторниот домаќин, како што се Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] и Leishmania [42].Протеините со густи гранули GRA35, GRA42 и GRA43, поврзани со вирулентноста на Toxoplasma gondii, се потребни за индукција на пироптоза кај макрофагите на стаорци Луис [43].Дополнително, некои студии за Лајшманија се фокусираа на поединечни молекули вклучени во инфламаторниот NLRP3, како што е паразитната мембрана липофосфогликан [44] или цинк металопротеаза [45].Помеѓу семејството на гени на алфа-џардини слични на анексин, алфа-1 џардин се покажа како потенцијален кандидат за вакцина што обезбедува заштита од G. duodenalis кај модел на глушец [18].Во нашата студија, избравме вирулентни фактори на G. duodenalis алфа-2 и алфа-7,3 џардини, кои се единствени за џардија, но релативно помалку пријавени.Овие два целни гени беа клонирани во векторот на еукариотскиот систем за изразување pcDNA3.1(+) за анализа на активирањето на воспалението.
Во нашиот модел на глушец, расцепените фрагменти на каспаза служат како маркери за активирање на воспалението.По стимулацијата, NLRP3 комуницира со ASC, регрутира прокаспази и генерира активни каспази кои ги расцепуваат про-IL-1β и про-IL-18 во зрели IL-1β и IL-18, соодветно -18.Воспалителните каспази (каспази-1, -4, -5 и -11) се конзервирана фамилија на цистеински протеази кои се критични за вродената одбрана и се вклучени во воспаление и програмирана клеточна смрт [46].Каспазата-1 се активира со канонски инфламазоми [47], додека каспазите-4, -5 и -11 се расцепуваат за време на формирањето на атипични инфламазоми [48].Во оваа студија, користевме перитонеални макрофаги на глувци како модел и ја истражувавме расцепената каспаза-1 на p20 каспаза-1 како маркер за активирање на воспалението на домаќинот NLRP3 во студиите за инфекција со G. duodenalis.Резултатите покажаа дека многу алфа-џардини се одговорни за типичното активирање на воспалението, што е во согласност со откривањето на клучните вирулентни молекули вклучени во бактериите и вирусите.Сепак, нашата студија е само прелиминарен екран и има други молекули кои можат да активираат некласични инфламазоми, бидејќи нашата претходна студија откри и класични и некласични инфламазоми кај инфекцијата со G. duodenalis [13].За понатамошно одредување дали генерираната p20 каспаза-1 е поврзана со инфламаторот NLRP3, ние трансфициравме алфа-2 и алфа-7,3 џардини во перитонеални макрофаги на глувчето за да ги одредиме нивоата на изразување на клучните молекули на протеинот и нивоата на олигомеризација на ASC, потврдувајќи дека и двата α-гиардини се активираат воспалителен NLRP3.Нашите резултати се малку поинакви од оние на Manko-Prykhoda et al., кои објавија дека стимулацијата на Caco-2 клетките само со G. muris или E. coli EPEC соеви може да го зголеми интензитетот на флуоресценција на NLRP3, ASC и каспаза-1, иако не значително, додека како костимулацијата на G. muris и E. coli ги зголеми нивоата на три протеини [49].Ова несовпаѓање може да се должи на разликите во изборот на видови Giardia, клеточни линии и примарни клетки.Исто така, извршивме ин виво анализи користејќи MCC950 кај женски глувци WT C57BL/6 стари 5 недели, кои се поподложни на G. duodenalis.MCC950 е моќен и селективен мал молекула NLRP3 инхибитор кој го блокира канонското и не-канонското NLRP3 активирање при наномоларни концентрации.MCC950 ја инхибира активирањето на NLRP3, но не влијае на активирањето на AIM2, NLRC4 и NLRP1 воспалителните патишта или патиштата за сигнализација на TLR [27].MCC950 го блокира активирањето на NLRP3, но не го инхибира започнувањето на NLRP3, одливот на K+, приливот на Ca2+ или интеракцијата помеѓу NLRP3 и ASC;наместо тоа, ја инхибира активирањето на инфламаторниот NLRP3 со блокирање на олигомеризацијата на ASC [27].Затоа, го користевме MCC950 во студија in vivo за да ја одредиме улогата на инфламаторниот NLRP3 по инјектирање на џардин.Активираната каспаза-1 p10 ги расцепува проинфламаторните цитокини про-IL-1β и про-IL-18 во зрели IL-1β и IL-18 [50].Во оваа студија, серумските нивоа на IL-1β кај глувци третирани со џардин со или без MCC950 беа користени како показател за тоа дали NLRP3 inflammasome е активиран.Како што се очекуваше, третманот со MCC950 значително ги намали серумските нивоа на IL-1β.Овие податоци јасно покажуваат дека G. duodenalis giardin alfa-2 и giardin alfa-7.3 се способни да го активираат NLRP3 воспалението на глувчето.
Значајните податоци акумулирани во текот на изминатата деценија покажаа дека IL-17A е главниот регулатор на имунитетот против G. muris, поттикнувајќи IL-17RA сигнализација, произведувајќи антимикробни пептиди и регулирајќи ја активацијата на комплементот [51].Сепак, инфекцијата со Giardia се јавува почесто кај млади возрасни лица, и беше пријавено дека инфекцијата со Giardia кај млади глувци не го активира одговорот на IL-17A за да го изврши својот заштитен ефект [52], што ги поттикнува истражувачите да бараат друга имуномодулаторна Giardia.механизми на инфекција со хелминти.Авторите на една неодамнешна студија објавија дека G. muris може да го активира NLRP3 inflammasome од E. coli EPEC, кој го промовира производството на антимикробни пептиди и го намалува неговиот капацитет за прицврстување и бројот на трофозоити во цревниот тракт, а со тоа ја намалува сериозноста на дебелото црево болести предизвикани од бацили [49].NLRP3 inflammasome е вклучен во развојот на разни болести.Студиите покажаа дека Pseudomonas aeruginosa предизвикува автофагија кај макрофагите за да се избегне клеточна смрт, а овој процес зависи од активирањето на NLRP3 инфламазомот [53].За N. caninum, реактивното активирање на инфламаторниот NLRP3 посредувано од видовите на кислород ја ограничува неговата репликација во домаќинот, што го прави потенцијална терапевтска цел [9].Утврдено е дека Paracoccidioides brasiliensis предизвикува активирање на инфламаторниот NLRP3 во дендритичните клетки добиени од коскената срцевина на глувчето, што резултира со ослободување на воспалителниот цитокин IL-1β, кој игра клучна улога во одбраната на домаќинот [10].Неколку видови Leishmania, вклучувајќи ги L. amazonensis, L. major, L. braziliensis и L. infantum chagasi, го активираат NLRP3 и ASC-зависниот каспаза-1 кај макрофагите, како и инфекцијата со Leishmania.Репликацијата на паразитот е засилена кај глувците со недостаток на генот NLRP3/ASC/caspase-1 [11].Замбони и сор.Пријавено е дека инфекцијата со лајшманија предизвикува активирање на инфламозомот NLRP3 кај макрофагите, што ја ограничува репликацијата на интрацелуларниот паразит.Така, Leishmania може да го инхибира активирањето на NLRP3 како стратегија за избегнување.Во in vivo студиите, инфламозомот NLRP3 придонесе за елиминација на Лајшманија, но не влијаеше на ткивата [54].Спротивно на тоа, во студиите за хелминтијаза, активирањето на инфламаторниот NLRP3 го потисна заштитниот имунитет на домаќинот против гастроинтестинална хелминтијаза [12].Шигелата е една од главните бактерии кои предизвикуваат дијареа ширум светот.Овие бактерии можат да индуцираат производство на IL-1β преку одлив на К+ посредуван од рецепторот P2X7, реактивни видови кислород, лизозомална киселост и митохондријално оштетување.Воспалението NLRP3 негативно ја регулира фагоцитозата и бактерицидната активност на макрофагите против шигелата [55].Студиите со плазмодиум покажаа дека глувците со дефицит на AIM2, NLRP3 или каспаза-1 инфицирани со плазмодиум произведуваат високи нивоа на тип 1 интерферон и се поотпорни на инфекција со плазмодиум [56].Сепак, улогата на алфа-2 џардин и алфа-7,3 џардин во поттикнувањето патогено активирање на воспалението на NLRP3 кај глувците е нејасна.
Во оваа студија, инхибицијата на NLRP3 inflammasome од MCC950 го намали BW и го зголеми бројот на трофозоити во течноста за интестинална лаважа кај глувците, што резултира со потешки патолошки промени во дуоденалното ткиво.Алфа-2 џардин и алфа-7,3 џардин го активираат инфламаторниот NLRP3 на глувчето домаќин, ја зголемуваат телесната тежина на глувчето, го намалуваат бројот на трофозоити во течноста за интестинална лаважа и ги ублажуваат патолошките дуоденални лезии.Овие резултати укажуваат на тоа дека G. duodenalis може да го активира NLRP3-домаќинот inflammasome преку алфа-2 џардин и алфа-7,3 џардин, намалувајќи ја патогеноста на G. duodenalis кај глувците.
Колективно, нашите резултати покажуваат дека алфа-2 и алфа-7.3 џардини предизвикуваат активирање на инфламазомот на домаќинот NLRP3 и ја намалуваат инфективноста на G. duodenalis кај глувците.Затоа, овие молекули се ветувачки цели за превенција од џардијаза.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Лианг АКС, Лианг ААМ, Хуанг АХЦ, Серги КМ, Кам ЈКМ.Џардијаза: преглед.Неодамна беше откриено дека Пат Инфлам е алергичен на лекови.2019; 13: 134-43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: преглед на фармакотерапијата.Стручно мислење на фармацевт.2007 година;8: 1885–902.
Тиан Хуафенг, Чен Бин, Вен Џијанфенг.Џардијаза, отпорност на лекови и откривање на нови цели.Ги инфицира целите на лекот Disord.2010; 10:295-302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T итн. NLRP3 инфламаторни и воспалителни болести.Oxide Med Cell Longev.2020; 2020: 4063562.
Chen GY, Núñez G. Улогата на inflammasome во интестинално воспаление и рак.Гастроентерологија.2011 година;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Каноничко и атипично NLRP3 инфламаторно активирање на раскрсницата на имунолошка толеранција и воспаление на цревата.предимуни.2017; 8:36.
Ли Л, Ванг XC, Гонг ПТ, Џанг Н, Џанг Икс, Ли С и др.Активацијата на инфламаторниот NLRP3 посредувана од ROS е вклучена како одговор на инфекцијата со N. caninum.Паразит вектор.2020; 13:449.