Ви благодариме што ја посетивте Nature.com.Верзијата на прелистувачот што ја користите има ограничена поддршка за CSS.За најдобро искуство, препорачуваме да користите ажуриран прелистувач (или да го оневозможите режимот на компатибилност во Internet Explorer).Во меѓувреме, за да обезбедиме континуирана поддршка, ќе ја направиме страницата без стилови и JavaScript.
Генските вектори за третман на пулмонална цистична фиброза мора да бидат насочени кон спроводливите дишни патишта, бидејќи периферната белодробна трансдукција нема терапевтски ефект.Ефикасноста на вирусната трансдукција е директно поврзана со времето на престој на носачот.Сепак, течностите за испорака како што се носители на гени природно дифундираат во алвеолите за време на вдишувањето, а терапевтските честички од која било форма брзо се отстрануваат со мукоцилијарен транспорт.Продолжувањето на времето на престој на носители на гени во респираторниот тракт е важно, но тешко е да се постигне.Коњугираните магнетни честички кои можат да се насочат кон површината на респираторниот тракт може да го подобрат регионалното таргетирање.Поради проблеми со in vivo сликите, однесувањето на таквите мали магнетни честички на површината на дишните патишта во присуство на применето магнетно поле е слабо разбрано.Целта на оваа студија беше да се користи синхротронска слика за да се визуелизира in vivo движењето на низа магнетни честички во душникот на анестезирани стаорци со цел да се проучат динамиката и моделите на однесување на единечни и големи честички in vivo.Потоа, исто така, проценивме дали испораката на лентивирусни магнетни честички во присуство на магнетно поле ќе ја зголеми ефикасноста на трансдукцијата во душникот на стаорецот.Синхротронската рендгенска слика го покажува однесувањето на магнетните честички во стационарни и подвижни магнетни полиња ин витро и ин виво.Честичките не можат лесно да се влечат низ површината на живите дишни патишта со помош на магнети, но за време на транспортот, наслагите се концентрираат во видното поле, каде што магнетното поле е најсилно.Ефикасноста на трансдукцијата исто така беше шесткратно зголемена кога лентивирусни магнетни честички беа испорачани во присуство на магнетно поле.Земени заедно, овие резултати сугерираат дека лентивирусните магнетни честички и магнетните полиња може да бидат вредни пристапи за подобрување на таргетирањето на генските вектори и нивоата на трансдукција во проводните дишни патишта in vivo.
Цистичната фиброза (CF) е предизвикана од варијации во еден ген наречен CF трансмембрански регулатор на спроводливост (CFTR).Протеинот CFTR е јонски канал кој е присутен во многу епителни клетки низ телото, вклучувајќи ги и дишните патишта, главно место во патогенезата на цистичната фиброза.Дефектите во CFTR доведуваат до абнормален транспорт на вода, дехидрација на површината на дишните патишта и намалена длабочина на течноста на површинскиот слој на дишните патишта (ASL).Исто така, ја нарушува способноста на мукоцилијарниот транспортен систем (MCT) да ги исчисти дишните патишта од вдишени честички и патогени.Нашата цел е да развиеме генетска терапија со лентивирусно (LV) за да ја дадеме точната копија на генот CFTR и да го подобриме ASL, MCT и здравјето на белите дробови, и да продолжиме да развиваме нови технологии кои можат да ги мерат овие параметри in vivo1.
LV вектори се еден од водечките кандидати за генска терапија за цистична фиброза, главно поради тоа што тие можат трајно да го интегрираат терапевтскиот ген во базалните клетки на дишните патишта (матични клетки на дишните патишта).Ова е важно бидејќи тие можат да ја вратат нормалната хидратација и клиренсот на слуз со диференцирање во функционални генски коригирани површински клетки на дишните патишта поврзани со цистична фиброза, што резултира со доживотни придобивки.LV вектори мора да бидат насочени против спроводливите дишни патишта, бидејќи тука започнува зафатеноста на белите дробови во CF.Доставувањето на векторот подлабоко во белите дробови може да резултира со алвеоларна трансдукција, но тоа нема терапевтски ефект кај цистичната фиброза.Меѓутоа, течностите како што се носители на гени природно мигрираат во алвеолите кога се вдишуваат по породувањето3,4 и терапевтските честички брзо се исфрлаат во усната шуплина преку MCTs.Ефикасноста на LV трансдукцијата е директно поврзана со должината на времето кога векторот останува блиску до целните клетки за да се овозможи клеточно навлегување - „време на престој“ 5 кое лесно се скратува со типичен регионален проток на воздух, како и со координирано навлегување на слуз и честички MCT.За цистична фиброза, способноста да се продолжи времето на престој на LV во дишните патишта е важна за да се постигнат високи нивоа на трансдукција во оваа област, но досега беше предизвик.
За да се надмине оваа пречка, предлагаме LV магнетните честички (MPs) да можат да помогнат на два комплементарни начини.Прво, тие можат да бидат водени со магнет до површината на дишните патишта за да се подобри таргетирањето и да им се помогне на честичките на носители на гени да бидат во вистинската област на дишните патишта;и ASL) се движат во клеточниот слој 6. Пратениците се широко користени како насочени возила за испорака на лекови кога се врзуваат за антитела, лекови за хемотерапија или други мали молекули кои се прикачуваат на клеточните мембрани или се врзуваат за нивните соодветни рецептори на клеточната површина и се акумулираат на туморските места во присуство на статички електрицитет.Магнетни полиња за терапија на рак 7. Други „хипертермични“ методи се насочени кон убивање на клетките на туморот со загревање на пратениците кога се изложени на осцилирачки магнетни полиња.Принципот на магнетна трансфекција, во кој магнетното поле се користи како средство за трансфекција за да се подобри трансферот на ДНК во клетките, вообичаено се користи in vitro со користење на низа не-вирусни и вирусни генски вектори за тешко трансдуцирачки клеточни линии. ..Утврдена е ефикасноста на LV магнетотрансфекцијата со испорака на LV MP in vitro во клеточна линија на човечки бронхијален епител во присуство на статичко магнетно поле, зголемувајќи ја ефикасноста на трансдукцијата за 186 пати во споредба само со LV векторот.LV MT исто така е применет на in vitro модел на цистична фиброза, каде што магнетната трансфекција ја зголеми LV трансдукцијата во културите на интерфејсот воздух-течна со фактор 20 во присуство на спутум од цистична фиброза10.Сепак, ин виво магнетотрансфекцијата на органи доби релативно мало внимание и беше оценета само во неколку студии на животни11,12,13,14,15, особено во белите дробови16,17.Сепак, можностите за магнетна трансфекција во белодробната терапија кај цистична фиброза се јасни.Тан и сор.(2020) изјави дека „студијата за валидација за ефективна пулмонална испорака на магнетни наночестички ќе го отвори патот за идните стратегии за инхалација на CFTR за подобрување на клиничките резултати кај пациенти со цистична фиброза“6.
Однесувањето на малите магнетни честички на површината на респираторниот тракт во присуство на применето магнетно поле е тешко да се визуелизира и проучува, па затоа тие се слабо разбрани.Во други студии, развивме метод на фазна контрастна рендгенска слика (PB-PCXI) засновано на пропагирање на синхротрон за неинвазивно сликање и квантификација на минутни in vivo промени во длабочината на ASL18 и однесувањето на MCT19,20 за директно мерење на хидратацијата на површината на гасниот канал и се користи како ран индикатор за ефективноста на третманот.Дополнително, нашиот метод на бодување MCT користи честички со дијаметар од 10–35 µm составени од алумина или стакло со висок индекс на рефракција како MCT маркери видливи со PB-PCXI21.Двата методи се погодни за сликање низа типови на честички, вклучително и MP.
Поради високата просторна и временска резолуција, нашите ASL и MCT тестови базирани на PB-PCXI се добро прилагодени за проучување на динамиката и моделите на однесување на единечни и масовни честички in vivo за да ни помогнат да ги разбереме и оптимизираме методите за испорака на MP ген.Пристапот што го користиме овде се заснова на нашите студии со помош на линијата SPring-8 BL20B2, во која го визуелизиравме движењето на течноста по испораката на доза на лажен вектор во носните и пулмоналните дишни патишта на глувците за да помогнеме во објаснувањето на нашите хетерогени шеми на генска експресија. во нашиот ген.студии на животни со носачка доза од 3,4 .
Целта на оваа студија беше да се користи PB-PCXI синхротронот за да се визуелизираат in vivo движењата на низа пратеници во душникот на живи стаорци.Овие студии за сликање PB-PCXI беа дизајнирани да ја тестираат серијата MP, јачината на магнетното поле и локацијата за да го одредат нивниот ефект врз движењето на MP.Претпоставувавме дека надворешното магнетно поле ќе му помогне на испорачаниот MF да остане или да се пресели во целната област.Овие студии ни овозможија да одредиме конфигурации на магнети кои го максимизираат количеството на честички оставени во душникот по таложењето.Во втората серија студии, имавме за цел да ја искористиме оваа оптимална конфигурација за да го демонстрираме моделот на трансдукција што произлегува од in vivo доставувањето на LV-MPs до дишните патишта на стаорци, под претпоставка дека испораката на LV-MPs во контекст на таргетирање на дишните патишта ќе резултира во зголемена ефикасност на трансдукција на НН..
Сите студии на животни беа спроведени во согласност со протоколите одобрени од Универзитетот во Аделаида (M-2019-060 и M-2020-022) и Комитетот за етика на животните за синхротрон SPring-8.Експериментите беа спроведени во согласност со препораките на ARRIVE.
Сите рендгенски снимки се направени на линијата BL20XU на синхротронот SPring-8 во Јапонија, користејќи поставка слична на онаа опишана претходно21,22.Накратко, експерименталната кутија се наоѓаше на 245 m од прстенот за складирање на синхротрон.Растојанието од примерок до детектор од 0,6 m се користи за студии за сликање со честички и 0,3 m за in vivo студии за сликање за да се создадат ефекти на фазен контраст.Искористен е монохроматски зрак со енергија од 25 keV.Сликите се добиени со помош на рендгенски трансдуктор со висока резолуција (SPring-8 BM3) поврзан со детектор sCMOS.Трансдуцерот ги конвертира рендгенските зраци во видлива светлина користејќи сцинтилатор со дебелина од 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), кој потоа се насочува кон сензорот sCMOS со помош на објектив за микроскоп ×10 (NA 0.3).Детекторот sCMOS беше Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Јапонија) со големина на низа од 2048 × 2048 пиксели и необработена големина на пиксели од 6,5 × 6,5 µm.Оваа поставка дава ефективна изотропна големина на пиксели од 0,51 µm и видно поле од приближно 1,1 mm × 1,1 mm.Времетраењето на експозицијата од 100 ms беше избрано за да се максимизира односот сигнал-шум на магнетните честички внатре и надвор од дишните патишта, притоа минимизирајќи ги артефактите од движењето предизвикани од дишењето.За ин виво студии, брза бленда за рендген беше поставена на патеката на Х-зраци за да се ограничи дозата на зрачење со блокирање на зракот на Х-зраци помеѓу експозициите.
LV медиумот не беше користен во ниту една студија за сликање SPring-8 PB-PCXI бидејќи комората за сликање BL20XU не е сертифицирана за биосигурност Ниво 2.Наместо тоа, избравме опсег на добро карактеризирани пратеници од двајца комерцијални продавачи кои покриваат опсег на големини, материјали, концентрации на железо и апликации - прво со цел да разбереме како магнетните полиња влијаат на движењето на пратениците во стаклените капилари, а потоа во живи дишни патишта.површина.Големината на MP варира од 0,25 до 18 µm и е направена од различни материјали (види Табела 1), но составот на секој примерок, вклучувајќи ја големината на магнетните честички во MP, е непознат.Врз основа на нашите опсежни MCT студии 19, 20, 21, 23, 24, очекуваме дека MP до 5 µm може да се видат на површината на дишните патишта на трахеата, на пример, со одземање последователни рамки за да се види подобрена видливост на движењето на MP.Еден MP од 0,25 µm е помал од резолуцијата на уредот за сликање, но се очекува PB-PCXI да го открие нивниот волуметриски контраст и движењето на површинската течност на која се депонирани откако ќе се депонираат.
Примероци за секој пратеник во табелата.1 беше подготвен во стаклени капилари од 20 μl (Drummond Microcaps, PA, USA) со внатрешен дијаметар од 0,63 mm.Корпускуларните честички се достапни во вода, додека честичките CombiMag се достапни во комерцијалната течност на производителот.Секоја епрувета е половина исполнета со течност (приближно 11 µl) и се става на држачот за примерок (види слика 1).Стаклените капилари беа поставени хоризонтално на сцената во комората за сликање, соодветно, и позиционирани на рабовите на течноста.На посебна табела за пренос за да се постигне Далечински сменете ја вашата позиција за време на рендерирање.Снимањето со Х-зраци започнува кога магнетот е поставен приближно 30 mm над примерокот и сликите се добиваат со 4 фрејмови во секунда.За време на снимањето, магнетот беше приближен до стаклената капиларна цевка (на растојание од околу 1 mm), а потоа се движеше по цевката за да се процени ефектот на јачината на полето и положбата.
Ин витро поставка за слика која содржи MP примероци во стаклени капилари во фазата на преведување на примерокот xy.Патеката на рендгенскиот зрак е означена со црвена линија со точки.
Откако беше воспоставена ин витро видливоста на пратениците, подгрупата од нив беше тестирана in vivo на женски албино стаорци од див тип (стари ~ 12 недели, ~ 200 g).Медетомидин 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Јапонија), мидазолам 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Јапонија) и буторфанол 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Стаорците беа анестезирани со мешавина на Фарма (Јапонија) со интраперитонеална инјекција.По анестезијата, тие беа подготвени за снимање со отстранување на крзното околу душникот, вметнување ендотрахеална цевка (ET; 16 Ga интравенска канила, Terumo BCT) и имобилизирање во лежечка положба на нарачана плоча за снимање што содржи термална кеса. за одржување на телесната температура.22. Плочата за снимање потоа беше прикачена на фазата на примерокот во кутијата за сликање под мал агол за да се усогласи душникот хоризонтално на сликата со рендген како што е прикажано на Слика 2а.
(а) Поставување сликање in vivo во единицата за сликање SPring-8, патека на зракот на Х-зраци означена со црвена линија со точки.(б, в) Локализацијата на трахеалниот магнет беше изведена од далечина со користење на две ортогонално монтирани IP камери.На левата страна од сликата на екранот, можете да ја видите жичаната јамка што ја држи главата и канилата за испорака инсталирана во ЕТ цевката.
Систем за пумпа за шприц со далечински управувач (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) со помош на стаклен шприц од 100 µl беше поврзан со цевка PE10 (0,61 mm OD, 0,28 mm ID) со помош на игла 30 Ga.Обележете ја цевката за да се осигурате дека врвот е во правилна положба во душникот кога ја вметнувате ендотрахеалната цевка.Со помош на микропумпа, клипот на шприцот беше отстранет и врвот на цевката беше потопен во MP примерокот што требаше да се испорача.Натоварената цевка за испорака потоа беше вметната во ендотрахеалната цевка, ставајќи го врвот на најсилниот дел од нашето очекувано применето магнетно поле.Стекнувањето на сликата беше контролирано со помош на детектор за здив поврзан со нашата кутија за тајминг базирана на Arduino, а сите сигнали (на пр., температура, дишење, отворање/затворање на блендата и стекнување слика) беа снимени со помош на Powerlab и LabChart (AD Instruments, Сиднеј, Австралија) 22 При сликање Кога куќиштето не беше достапно, две IP камери (Panasonic BB-SC382) беа поставени на приближно 90° една до друга и се користеа за контрола на положбата на магнетот во однос на душникот за време на снимањето (Слика 2б, в).За да се минимизираат артефактите од движењето, една слика по здив беше добиена за време на платото на терминалниот респираторен проток.
Магнетот е прикачен на втората фаза, која може да се наоѓа оддалеку од надворешната страна на телото за сликање.Беа тестирани различни позиции и конфигурации на магнетот, вклучувајќи: поставен под агол од приближно 30° над душникот (конфигурациите се прикажани на сликите 2а и 3а);еден магнет над животното, а другиот долу, со поставените столбови за привлекување (Слика 3б)., еден магнет над животното и еден долу, со столбовите поставени за одбивање (слика 3в), и еден магнет над и нормално на душникот (Слика 3г).По поставувањето на животното и магнетот и вчитувањето на MP под тест во пумпата за шприц, доставете доза од 50 µl со брзина од 4 µl/sec по добивањето на сликите.Магнетот потоа се движи напред-назад по должината или преку душникот додека продолжува да добива слики.
Конфигурација на магнет за in vivo слика (а) еден магнет над душникот под агол од приближно 30°, (б) два магнети конфигурирани за привлекување, (в) два магнети конфигурирани за одбивање, (г) еден магнет над и нормално на душникот.Набљудувачот погледнал од устата до белите дробови низ душникот и рендгенскиот зрак поминал низ левата страна на стаорецот и излегувал од десната страна.Магнетот или се движи по должината на дишните патишта или лево и десно над душникот во насока на зракот на Х-зраци.
Исто така, баравме да ја одредиме видливоста и однесувањето на честичките во дишните патишта во отсуство на мешање на дишењето и отчукувањата на срцето.Затоа, на крајот од периодот на снимање, животните беа хумано еутанизирани поради предозирање со пентобарбитал (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, САД; ~65 mg/kg IP).Некои животни беа оставени на платформата за снимање, а по престанокот на дишењето и отчукувањата на срцето, процесот на снимање се повторуваше, додавајќи дополнителна доза MP доколку на површината на дишните патишта не се гледаше MP.
Добиените слики беа коригирани за рамно и темно поле, а потоа се составија во филм (20 фрејмови во секунда; 15–25 × нормална брзина во зависност од стапката на дишење) користејќи приспособена скрипта напишана во MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Сите студии за испорака на вектори на LV ген беа спроведени во Лабораторискиот истражувачки центар за животни на Универзитетот во Аделаида и имаа за цел да ги искористат резултатите од експериментот SPring-8 за да проценат дали испораката на LV-MP во присуство на магнетно поле може да го подобри трансферот на генот in vivo .За да се проценат ефектите на MF и магнетното поле, беа третирани две групи животни: едната група беше инјектирана со LV MF со поставување магнет, а на другата група беше инјектирана со контролна група со LV MF без магнет.
LV генските вектори се генерирани со користење на претходно опишаните методи 25, 26.Векторот LacZ изразува нуклеарен локализиран ген на бета-галактозидаза управуван од MPSV конститутивниот промотор (LV-LacZ), кој произведува син реакција производ во трансдуцираните клетки, видлив на предните делови и деловите на ткивото на белите дробови.Титрацијата беше изведена во клеточни култури со рачно броење на бројот на LacZ позитивни клетки со помош на хемоцитометар за да се пресмета титарот во TU/ml.Носачите се криопрезервираат на -80°C, се одмрзнуваат пред употреба и се врзуваат за CombiMag со мешање 1:1 и инкубирање на мраз најмалку 30 минути пред испораката.
Нормални стаорци Sprague Dawley (n = 3/група, ~2-3 анестезирани IP со мешавина од 0,4 mg/kg медетомидин (Domitor, Ilium, Австралија) и 60 mg/kg кетамин (Ilium, Австралија) на возраст од 1 месец) IP ) инјекција и нехируршка орална канулација со 16 Ga интравенска канила.За да се осигури дека ткивото на трахеалните дишни патишта добива LV трансдукција, тоа беше условено со користење на нашиот претходно опишан протокол за механичка пертурбација во кој површината на дишните патишта на трахеата беше аксијално триење со жичена корпа (N-Circle, екстрактор за камења од нитинол без врв NTSE-022115) -UDH. Кук Медикал, САД) 30 стр28.Потоа, околу 10 минути по пертурбацијата во кабинетот за биосигурност, беше извршена трахеална администрација на LV-MP.
Магнетното поле користено во овој експеримент беше конфигурирано слично на студијата со рентген in vivo, со истите магнети кои се држат над душникот со стеги за дестилација (слика 4).Волумен од 50 µl (2 x 25 µl делови) од LV-MP беше доставен до душникот (n = 3 животни) со помош на пипета со врвот на гел како што е опишано претходно.Контролната група (n = 3 животни) го доби истиот LV-MP без употреба на магнет.По завршувањето на инфузијата, канилата се отстранува од ендотрахеалната цевка и животното се екстубира.Магнетот останува на место 10 минути пред да се отстрани.На стаорците им беше дозирана субкутано мелоксикам (1 ml/kg) (Ilium, Австралија) проследено со повлекување на анестезијата со интраперитонеална инјекција од 1 mg/kg атипамазол хидрохлорид (Antisedan, Zoetis, Австралија).Стаорците беа чувани на топло и набљудувани до целосно закрепнување од анестезијата.
LV-MP уред за испорака во кабинет за биолошка безбедност.Можете да видите дека светло сивата Luer-lock чаура на ET цевката излегува од устата, а врвот на гел-пипетата прикажан на сликата е вметнат преку ET цевката до саканата длабочина во душникот.
Една недела по процедурата за администрација на LV-MP, животните беа хумано жртвувани со вдишување на 100% CO2 и експресијата на LacZ беше проценета со користење на нашиот стандарден третман X-gal.Трите најопашки прстени на 'рскавицата беа отстранети за да се осигура дека секое механичко оштетување или задржување на течности поради поставување на ендотрахеалната цевка нема да бидат вклучени во анализата.Секоја трахеа беше исечена по должина за да се добијат две половини за анализа и ставена во чаша која содржи силиконска гума (Sylgard, Dow Inc) со помош на игла Minutien (Fine Science Tools) за да се визуелизира луминалната површина.Распределбата и карактерот на трансдуцираните ќелии беа потврдени со фронтална фотографија со помош на микроскоп Nikon (SMZ1500) со камера DigiLite и софтвер TCapture (Tucsen Photonics, Кина).Сликите беа добиени со 20x зголемување (вклучувајќи го максималното подесување за целосната ширина на душникот), при што целата должина на душникот се прикажува чекор по чекор, обезбедувајќи доволно преклопување помеѓу секоја слика за да се овозможи сликите да се „зашијат“.Сликите од секоја душница потоа беа комбинирани во една композитна слика со помош на Composite Image Editor верзија 2.0.3 (Microsoft Research) користејќи го алгоритамот за рамни движења. Областа на LacZ изразување во рамките на трахеалните композитни слики од секое животно беше квантифицирана со помош на автоматизирана MATLAB скрипта (R2020a, MathWorks) како што беше претходно опишано28, користејќи поставки од 0,35 <Нијанса <0,58, заситеност > 0,15 и вредност <0,7. Областа на LacZ израз во рамките на трахеалните композитни слики од секое животно беше квантифицирана со помош на автоматизирана MATLAB скрипта (R2020a, MathWorks) како што беше претходно опишано28, користејќи поставки од 0,35 <Нијанса < 0,58, Сатурација > 0,15 и Вредност <0,7. Площадь экспрессии LacZ во составных изображениях трахеи од каждого животно была количествена определена со использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), какo описано на <5,28, насыщенность> 0,15 и значење <0 , 7. Областа на LacZ изразување во композитни трахеални слики од секое животно беше квантифицирана со помош на автоматизирана MATLAB скрипта (R2020a, MathWorks) како што беше претходно опишано28 користејќи поставки од 0,350,15 и вредност<0 ,7.如前所述，使用自动MATLAB 脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动物的气管复合合脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动物的气管复合可进行量化，使用0,35 < 色调< 0,58、饱和度> 0,15 和值< 0,7 的设置。如 前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a ， Mathworks） 来自 每 只 的 气管 复表达 量化 ， 使用 使用 使用 0,35 <色调 <0,58 、> 0,15 和值 <0,7 的。。。。 .. ........ Области экспрессии LacZ на составни изображениях трахеи каждого животно количествено определи со использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), како описано ранее, со искористување <5,000 нам 0,15 и значење <0,7 . Областите на LacZ изразување на композитните слики на душникот на секое животно беа квантифицирани со помош на автоматизирана MATLAB скрипта (R2020a, MathWorks) како што беше претходно опишано со поставки од 0,35 < нијанса < 0,58, заситеност > 0,15 и вредност < 0,7 .Со следење на ткивните контури во GIMP v2.10.24, рачно беше создадена маска за секоја композитна слика за да се идентификува областа на ткивото и да се спречат какви било лажни откривања надвор од ткивото на душникот.Обоените области од сите композитни слики од секое животно беа сумирани за да се даде вкупната обоена површина за тоа животно.Обоената површина потоа беше поделена со вкупната површина на маската за да се добие нормализирана површина.
Секоја трахеа беше вградена во парафин и пресечена со дебелина од 5 µm.Пресеците беа контрабоени со неутрално брзо црвено 5 минути и сликите беа добиени со помош на микроскоп Nikon Eclipse E400, камера DS-Fi3 и софтвер за снимање елементи NIS (верзија 5.20.00).
Сите статистички анализи беа направени во GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Статистичката значајност беше поставена на p ≤ 0,05.Нормалноста беше тестирана со користење на Shapiro-Wilk тестот и разликите во боењето со LacZ беа оценети со помош на неспарен t-тест.
Шесте MPs опишани во Табела 1 беа испитани со PCXI, а видливоста е опишана во Табела 2. Два полистиренски MPs (MP1 и MP2; 18 µm и 0,25 µm, соодветно) не беа видливи со PCXI, но преостанатите примероци можеа да се идентификуваат (примерите се прикажани на слика 5).MP3 и MP4 се слабо видливи (10-15% Fe3O4; 0,25 µm и 0,9 µm, соодветно).Иако MP5 (98% Fe3O4; 0,25 µm) содржеше некои од најмалите тестирани честички, тој беше најизразен.Производот CombiMag MP6 е тешко да се разликува.Во сите случаи, нашата способност за откривање на MF беше значително подобрена со движење на магнетот напред-назад паралелно со капиларот.Како што магнетите се оддалечуваа од капиларот, честичките беа извлечени во долги синџири, но како што магнетите се приближуваа и јачината на магнетното поле се зголемуваше, синџирите на честичките се скратија како што честичките мигрираа кон горната површина на капиларот (види Дополнително видео S1 : MP4), зголемување на густината на честичките на површината.Спротивно на тоа, кога магнетот е отстранет од капиларот, јачината на полето се намалува и пратениците се преуредуваат во долги синџири што се протегаат од горната површина на капиларот (види Дополнително видео S2: MP4).Откако магнетот ќе престане да се движи, честичките продолжуваат да се движат некое време откако ќе ја достигнат положбата на рамнотежа.Како што MP се движи кон и подалеку од горната површина на капиларот, магнетните честички имаат тенденција да влечат остатоци низ течноста.
Видливоста на MP под PCXI значително варира помеѓу примероците.(а) MP3, (б) MP4, (в) MP5 и (г) MP6.Сите слики прикажани овде се направени со магнет поставен приближно 10 mm директно над капиларот.Очигледните големи кругови се воздушни меури заробени во капиларите, јасно покажувајќи ги црно-белите карактеристики на рабовите на сликата со фазен контраст.Црвеното поле го означува зголемувањето што го подобрува контрастот.Забележете дека дијаметрите на магнетните кола на сите слики не се со големина и се приближно 100 пати поголеми од прикажаното.
Како што магнетот се движи лево и десно по врвот на капиларот, аголот на низата MP се менува за да се усогласи со магнетот (види Слика 6), со што се оцртуваат линиите на магнетното поле.За MP3-5, откако акордот ќе го достигне аголот на прагот, честичките се влечат по горната површина на капиларот.Ова често резултира со групирање на пратениците во поголеми групи во близина на местото каде што магнетното поле е најсилно (види Дополнително видео S3: MP5).Ова е особено очигледно кога се слика блиску до крајот на капиларот, што предизвикува MP да се собира и концентрира на интерфејсот течен воздух.Честичките во MP6, кои беа потешки за разликување од оние во MP3-5, не се влечеа кога магнетот се движеше по капиларот, но низите MP се дисоцираа, оставајќи ги честичките во вид (види Дополнително видео S4: MP6).Во некои случаи, кога применетото магнетно поле беше намалено со поместување на магнетот на долго растојание од местото на снимање, сите преостанати пратеници полека се спуштаа на долната површина на цевката поради гравитацијата, останувајќи во низата (види Дополнително видео S5: MP3) .
Аголот на низата MP се менува кога магнетот се движи десно над капиларот.(а) MP3, (б) MP4, (в) MP5 и (г) MP6.Црвеното поле го означува зголемувањето што го подобрува контрастот.Имајте предвид дека дополнителните видеа се за информативни цели бидејќи откриваат важна структура на честички и динамички информации што не можат да се визуелизираат на овие статични слики.
Нашите тестови покажаа дека бавното движење на магнетот напред-назад по должината на душникот ја олеснува визуелизацијата на MF во контекст на сложено движење in vivo.Не беа извршени in vivo тестови бидејќи полистиренските зрна (MP1 и MP2) не беа видливи во капиларот.Секој од преостанатите четири MF беше тестиран in vivo со долгата оска на магнетот позиционирана над душникот под агол од околу 30° во однос на вертикалата (видете ги сликите 2б и 3а), бидејќи тоа резултираше со подолги MF синџири и беше поефективно отколку магнет..конфигурацијата е прекината.MP3, MP4 и MP6 не се пронајдени во душникот на ниту едно живо животно.При визуелизација на респираторниот тракт на стаорци по хуманото убивање на животните, честичките останале невидливи дури и кога се додавал дополнителен волумен со помош на пумпа за шприц.MP5 имаше најголема содржина на железен оксид и беше единствената видлива честичка, па затоа се користеше за оценување и карактеризирање на однесувањето на MP in vivo.
Поставувањето на магнетот над душникот за време на вметнувањето на MF резултираше со многу, но не сите, MF да се концентрираат во видното поле.Внесувањето на честички во трахеата најдобро се забележува кај хумано еутанизираните животни.Слика 7 и дополнително видео S6: MP5 покажува брзо магнетно зафаќање и усогласување на честичките на површината на вентралната трахеа, што покажува дека MPs може да бидат насочени кон саканите области на душникот.При пребарување подалечно по должината на душникот по испораката на MF, некои MF беа пронајдени поблиску до карина, што укажува на недоволна јачина на магнетно поле за собирање и задржување на сите MF, бидејќи тие беа испорачани низ регионот на максимална јачина на магнетно поле за време на администрацијата на течноста.процес.Сепак, постнаталните концентрации на MP беа повисоки околу областа на сликата, што сугерира дека многу пратеници останале во регионите на дишните патишта каде што применетата јачина на магнетното поле е најголема.
Слики од (а) пред и (б) по испорака на MP5 во душникот на неодамна еутанизиран стаорец со магнет поставен веднаш над областа за снимање.Прикажаната област се наоѓа помеѓу два 'рскавични прстени.Има малку течност во дишните патишта пред да се испорача MP.Црвеното поле го означува зголемувањето што го подобрува контрастот.Овие слики се преземени од видеото прикажано во S6: MP5 Дополнително видео.
Поместувањето на магнетот по должината на душникот in vivo резултираше со промена на аголот на MP синџирот на површината на дишните патишта, слична на онаа забележана во капиларите (види Слика 8 и Дополнително видео S7: MP5).Меѓутоа, во нашата студија, пратениците не можеа да се влечат по површината на живите респираторни патишта, како што тоа можеа да го направат капиларите.Во некои случаи, ланецот MP се издолжува додека магнетот се движи лево и десно.Интересно, откривме и дека синџирот на честички ја менува длабочината на површинскиот слој на течноста кога магнетот се поместува надолжно по должината на душникот и се шири кога магнетот се движи директно над главата и синџирот на честички се ротира во вертикална положба (види Дополнително видео S7).: MP5 на 0:09, долу десно).Карактеристичниот модел на движење се промени кога магнетот беше поместен странично преку врвот на душникот (т.е. лево или десно од животното, наместо по должината на трахеата).Честичките сè уште беа јасно видливи за време на нивното движење, но кога магнетот беше отстранет од душникот, врвовите на низите на честичките станаа видливи (видете Дополнително видео S8: MP5, почнувајќи од 0:08).Ова се согласува со набљудуваното однесување на магнетното поле под дејство на применето магнетно поле во стаклен капилар.
Примероци на слики кои покажуваат MP5 во душникот на жив анестезиран стаорец.(а) Магнетот се користи за стекнување слики над и лево од душникот, а потоа (б) по движењето на магнетот надесно.Црвеното поле го означува зголемувањето што го подобрува контрастот.Овие слики се од видеото прикажано во дополнителното видео на S7: MP5.
Кога двата пола беа наместени во ориентација север-југ над и под душникот (т.е. привлекување; Сл. 3б), MP акордите се појавија подолги и се наоѓаа на страничниот ѕид на душникот наместо на дорзалната површина на душникот (види Додаток).Видео S9: MP5).Сепак, високи концентрации на честички на едно место (т.е. дорзалната површина на душникот) не беа откриени по администрација на течност со користење на уред со двоен магнет, што обично се јавува со еден уред со магнет.Потоа, кога еден магнет беше конфигуриран да ги одбива спротивните полови (Слика 3в), бројот на честички видливи во видното поле не се зголеми по испораката.Поставувањето на двете конфигурации на магнети е предизвик поради високата јачина на магнетното поле што ги привлекува или турка магнетите соодветно.Поставувањето потоа беше сменето во еден магнет паралелен со дишните патишта, но минува низ дишните патишта под агол од 90 степени, така што линиите на сила го преминаа ѕидот на трахеата ортогонално (слика 3г), ориентација наменета да ја одреди можноста за агрегација на честички на страничниот ѕид.да се набљудува.Меѓутоа, во оваа конфигурација, немаше препознатливо движење на акумулација на MF или движење на магнет.Врз основа на сите овие резултати, беше избрана конфигурација со еден магнет и ориентација од 30 степени за in vivo студии на носители на гени (сл. 3а).
Кога животното било снимено повеќе пати веднаш откако било хумано жртвувано, отсуството на попречувачко движење на ткивото значело дека може да се забележат пофини, пократки линии на честички во чистото меѓурскавично поле, „нишајќи“ во согласност со преводното движење на магнетот.јасно да се види присуството и движењето на MP6 честичките.
Титарот на LV-LacZ беше 1,8 x 108 IU/mL, а по мешањето 1:1 со CombiMag MP (MP6), на животните им беа инјектирани 50 μl од трахеална доза од 9 x 107 IU/ml од LV возило (т.е. 4,5 x 106 TU/стаорец).)).Во овие студии, наместо да го придвижуваме магнетот за време на породувањето, го фиксиравме магнетот во една позиција за да одредиме дали LV трансдукцијата може (а) да се подобри во споредба со векторската испорака во отсуство на магнетно поле и (б) дали дишните патишта може бидете фокусирани.Клетките се трансдуцираат во магнетните целни области на горниот респираторен тракт.
Присуството на магнети и употребата на CombiMag во комбинација со LV вектори не се чини дека влијае негативно врз здравјето на животните, како што тоа го направи нашиот стандарден протокол за испорака на вектори на LV.Фронталните слики на трахеалниот регион подложен на механички пертурбации (Дополнителна слика 1) покажаа дека групата третирана со LV-MP имаше значително повисоки нивоа на трансдукција во присуство на магнет (сл. 9а).Само мала количина на сино LacZ боење беше присутна во контролната група (Слика 9б).Квантификацијата на нормализираните региони обоени со X-Gal покажа дека администрацијата на LV-MP во присуство на магнетно поле резултираше со приближно 6-кратно подобрување (сл. 9в).
Пример на композитни слики кои покажуваат трахеална трансдукција со LV-MP (а) во присуство на магнетно поле и (б) во отсуство на магнет.(в) Статистички значајно подобрување во нормализираната област на трансдукција на LacZ во душникот со употреба на магнет (*p = 0,029, t-тест, n = 3 по група, средна ± стандардна грешка на средната вредност).
Неутралните брзо црвено обоени делови (примерот прикажан на дополнителната слика 2) покажаа дека клетките обоени со LacZ се присутни во истиот примерок и на истата локација како што беше претходно објавено.
Клучниот предизвик во генската терапија на дишните патишта останува прецизната локализација на честичките носители во областите од интерес и постигнувањето на високо ниво на ефикасност на трансдукција во мобилното белодробно крило во присуство на проток на воздух и активен клиренс на слуз.За LV носителите наменети за третман на респираторни заболувања кај цистична фиброза, зголемувањето на времето на престој на честичките-носители во проводните дишни патишта досега беше недостижна цел.Како што е истакнато од Castellani et al., употребата на магнетни полиња за подобрување на трансдукцијата има предности во однос на другите методи за испорака на гени, како што е електропорацијата, бидејќи може да комбинира едноставност, економичност, локализирана испорака, зголемена ефикасност и пократко време на инкубација.а можеби и помала доза на возило10.Сепак, in vivo таложењето и однесувањето на магнетните честички во дишните патишта под влијание на надворешните магнетни сили никогаш не е опишано, а всушност способноста на овој метод да го зголеми нивото на генска експресија во непроменети живи дишни патишта не е докажана in vivo.
Нашите ин витро експерименти на PCXI синхротронот покажаа дека сите честички што ги тестиравме, со исклучок на MP полистиренот, беа видливи во поставувањето слики што ги користевме.Во присуство на магнетно поле, магнетните полиња формираат жици, чија должина е поврзана со видот на честичките и јачината на магнетното поле (т.е. близината и движењето на магнетот).Како што е прикажано на Слика 10, жиците што ги набљудуваме се формираат кога секоја поединечна честичка станува магнетизирана и индуцира свое локално магнетно поле.Овие посебни полиња предизвикуваат други слични честички да се соберат и да се поврзат со групни движења на жици поради локалните сили од локалните сили на привлекување и одбивање на други честички.
Дијаграм кој покажува (а, б) синџири на честички кои се формираат во капилари исполнети со течност и (в, г) душник исполнет со воздух.Имајте на ум дека капиларите и душникот не се навлечени на скала.Панелот (а) исто така содржи опис на MF што содржи честички Fe3O4 распоредени во синџири.
Кога магнетот се движеше над капиларот, аголот на низата на честичките го достигна критичниот праг за MP3-5 што содржи Fe3O4, по што низата на честичките повеќе не остана во првобитната положба, туку се пресели по површината во нова положба.магнет.Овој ефект најверојатно се јавува затоа што површината на стаклената капиларна е доволно мазна за да дозволи ова движење да се случи.Интересно е тоа што MP6 (CombiMag) не се однесуваше вака, можеби затоа што честичките беа помали, имаа различна обвивка или површинско полнење, или комерцијалната носечка течност влијаеше на нивната способност да се движат.Контрастот во сликата на честичките CombiMag е исто така послаб, што сугерира дека течноста и честичките може да имаат иста густина и затоа не можат лесно да се движат една кон друга.Честичките исто така може да се заглават ако магнетот се движи пребрзо, што покажува дека јачината на магнетното поле не може секогаш да го надмине триењето помеѓу честичките во течноста, што сугерира дека јачината на магнетното поле и растојанието помеѓу магнетот и целната област не треба да бидат како изненадување.важно.Овие резултати, исто така, укажуваат дека иако магнетите можат да фатат многу микрочестички што течат низ целната област, малку е веројатно дека може да се потпреме на магнети за да ги поместат честичките CombiMag по површината на душникот.Така, заклучивме дека in vivo LV MF студиите треба да користат статички магнетни полиња за физички да таргетираат одредени области на дрвото на дишните патишта.
Штом честичките ќе бидат доставени во телото, тешко е да се идентификуваат во контекст на сложеното подвижно ткиво на телото, но нивната способност за откривање е подобрена со поместување на магнетот хоризонтално над душникот за да ги „мрда“ жиците MP.Иако е можно снимање во реално време, полесно е да се препознае движењето на честичките откако животното е хумано убиено.Концентрациите на MP обично беа највисоки на оваа локација кога магнетот беше позициониран над областа за снимање, иако некои честички обично се наоѓаа подалеку од душникот.За разлика од ин витро студиите, честичките не можат да се влечат по трахеата со движење на магнет.Овој наод е конзистентен со тоа како слузта што ја покрива површината на душникот обично ги обработува вдишените честички, заробувајќи ги во слузта и последователно чистејќи ги преку механизмот за муко-цилијарно клиренс.
Претпоставивме дека користењето магнети над и под душникот за привлекување (сл. 3б) може да резултира со порамномерно магнетно поле, наместо магнетно поле кое е високо концентрирано во една точка, што потенцијално ќе резултира со порамномерна распределба на честичките..Сепак, нашата прелиминарна студија не најде јасни докази за поддршка на оваа хипотеза.Слично на тоа, поставувањето на пар магнети за одбивање (сл. 3в) не резултираше со таложење на повеќе честички во областа на сликата.Овие две наоди покажуваат дека поставувањето со двоен магнет не ја подобрува значително локалната контрола на покажувањето на MP, и дека добиените силни магнетни сили тешко се прилагодуваат, што го прави овој пристап помалку практичен.Слично на тоа, ориентирањето на магнетот над и преку душникот (Слика 3г) исто така не го зголеми бројот на честички што остануваат во снимената област.Некои од овие алтернативни конфигурации можеби нема да бидат успешни бидејќи резултираат со намалување на јачината на магнетното поле во зоната на таложење.Така, конфигурацијата на еден магнет на 30 степени (сл. 3а) се смета за наједноставниот и најефикасен метод за тестирање in vivo.
Студијата LV-MP покажа дека кога LV вектори биле комбинирани со CombiMag и испорачани откако биле физички вознемирени во присуство на магнетно поле, нивоата на трансдукција значително се зголемиле во душникот во споредба со контролите.Врз основа на студиите за синхротронска слика и резултатите од LacZ, се чини дека магнетното поле може да го задржи LV во душникот и да го намали бројот на векторски честички кои веднаш навлегле длабоко во белите дробови.Ваквите подобрувања на таргетирањето може да доведат до поголема ефикасност, истовремено намалувајќи ги испорачаните титри, нетаргетирана трансдукција, воспалителни и имунолошки несакани ефекти и трошоците за трансфер на гени.Поважно, според производителот, CombiMag може да се користи во комбинација со други методи за пренос на гени, вклучително и други вирусни вектори (како AAV) и нуклеински киселини.