Ви благодариме што ја посетивте Nature.com.Верзијата на прелистувачот што ја користите има ограничена поддршка за CSS.За најдобро искуство, препорачуваме да користите ажуриран прелистувач (или да го оневозможите режимот на компатибилност во Internet Explorer).Во меѓувреме, за да обезбедиме континуирана поддршка, ќе ја направиме страницата без стилови и JavaScript.
Toxoplasma gondii е интрацелуларен протозоен паразит кој ја модулира микросредината на инфицираниот домаќин и е познато дека е поврзан со инциденцата на раст на туморот на мозокот.Во оваа студија, претпоставуваме дека егзосомната miRNA-21 од инфекцијата со токсоплазма го промовира растот на туморот на мозокот.Егзозомите од BV2 микроглија инфицирани со токсоплазма беа карактеризирани и беше потврдена интернализација на U87 глиомските клетки.Егзозомните профили на експресијата на микроРНК беа анализирани со помош на низи од микроРНК и микроРНК-21А-5р поврзани со Toxoplasma gondii и сортирање на туморот.Ние, исто така, ги истражувавме нивоата на mRNA на гените поврзани со туморот во клетките на глиомот U87 со менување на нивоата на miR-21 во егзосомите и ефектот на егзосомите врз пролиферацијата на човечката глиомска клетка U87.Во егзосомите на U87 глиомските клетки инфицирани со Toxoplasma gondii, експресијата на микроРНК-21 е зголемена и активноста на антитуморните гени (FoxO1, PTEN и PDCD4) е намалена.Егзозомите добиени од BV2 инфицирани со Toxoplasma индуцираат пролиферација на U87 глиомските клетки.Егзозомите индуцираат раст на U87 клетки во модел на тумор на глушец.Предлагаме дека зголемениот егзозомски miR-21 кај микроглија BV2 инфицирани со токсоплазма може да игра важна улога како промотор на клеточниот раст во клетките на глиомот U87 со намалување на антитуморните гени.
Се проценува дека повеќе од 18,1 милиони случаи на напреднат карцином биле дијагностицирани во светот во 2018 година, со околу 297.000 тумори на централниот нервен систем дијагностицирани секоја година (1,6% од сите тумори)1.Претходните истражувања покажаа дека факторите на ризик за развој на тумори на човечкиот мозок вклучуваат различни хемиски производи, семејна историја и јонизирачко зрачење од терапевтска и дијагностичка опрема на главата.Сепак, точната причина за овие малигни тумори е непозната.Приближно 20% од сите видови на рак во светот се предизвикани од инфективни агенси, вклучувајќи вируси, бактерии и паразити3,4.Заразните патогени ги нарушуваат генетските механизми на клетката домаќин, како што се поправката на ДНК и клеточниот циклус, и може да доведат до хронично воспаление и оштетување на имунолошкиот систем5.
Инфективните агенси поврзани со човечкиот рак се најчестите вирусни патогени, вклучувајќи ги хуманите папиломавируси и вирусите на хепатитис Б и Ц.Паразитите исто така можат да играат потенцијална улога во развојот на ракот кај луѓето.Неколку видови паразити, имено Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis и Hymenolepis nana, се вмешани во различни видови на човечки рак 6,7,8.
Toxoplasma gondii е интрацелуларен протозоа кој ја регулира микросредината на инфицираните клетки домаќини.Се проценува дека овој паразит инфицира приближно 30% од светската популација, ставајќи ја целата популација во ризик9,10.Toxoplasma gondii може да зарази витални органи, вклучувајќи го и централниот нервен систем (ЦНС) и да предизвика сериозни болести како што се фатален менингитис и енцефалитис, особено кај имунокомпромитирани пациенти9.Сепак, Toxoplasma gondii, исто така, може да ја промени средината на заразениот домаќин со модулирање на клеточниот раст и имунолошкиот одговор кај имунокомпетентните индивидуи, што доведува до одржување на асимптоматска хронична инфекција9,11.Интересно, со оглед на корелацијата помеѓу преваленцата на T. gondii и инциденцата на тумор на мозокот, некои извештаи сугерираат дека in vivo промените на животната средина на домаќинот поради хронична инфекција со T. gondii личат на микросредината на туморот.
Егзозомите се познати како меѓуклеточни комуникатори кои испорачуваат биолошка содржина, вклучувајќи протеини и нуклеински киселини, од соседните клетки16,17.Егзозомите можат да влијаат на биолошките процеси поврзани со туморот, како што се анти-апоптозата, ангиогенезата и метастазите во микросредината на туморот.Особено, miRNAs (miRNAs), малите некодирачки РНК со должина од околу 22 нуклеотиди, се важни пост-транскрипциски генски регулатори кои контролираат повеќе од 30% од човечката mRNA преку комплексот за замолчување индуциран од miRNA (miRISC).Toxoplasma gondii може да ги наруши биолошките процеси со контролирање на експресијата на miRNA кај инфицираните домаќини.МиРНК на домаќинот содржи важни сигнали за регулирање на биолошките процеси на домаќинот за да се постигне стратегијата за преживување на паразитот.Така, проучувањето на промените во профилот на miRNA на домаќинот при инфекција со T. gondii може да ни помогне појасно да ја разбереме интеракцијата помеѓу домаќинот и T. gondii.Навистина, Thirugnanam et al.15 сугерираше дека T. gondii ја промовира канцерогенезата на мозокот со менување на неговиот израз на специфичните miRNAs на домаќините поврзани со растот на туморот и откри дека T. gondii може да предизвика глиоми кај експерименталните животни.
Оваа студија се фокусира на промената на егзозомниот miR-21 кај микроглијата на домаќинот инфицирани со Toxoplasma BV2.Забележавме можна улога на изменетиот егзозомски miR-21 во растот на U87 глиомските клетки поради задржувањето во јадрото на FoxO1/p27, кое е цел на прекумерно изразен miR-21.
Егзозомите добиени од BV2 беа добиени со помош на диференцијална центрифугирање и потврдени со различни методи за да се спречи контаминација со клеточни компоненти или други везикули.СДС-полиакриламид гел електрофореза (SDS-PAGE) покажа различни шеми помеѓу протеините извлечени од BV2 клетките и егзосомите (слика 1А), а примероците беа оценети за присуство на Alix, кој беше анализиран со вестерн blotting на маркери на егзозомски протеин во.Обележувањето Alix беше пронајдено во протеините на егзозомите, но не и во протеините на лиза на клетките BV2 (сл. 1Б).Дополнително, прочистена РНК од егзосомите добиени од BV2 беше анализирана со помош на биоанализатор.18S и 28S рибозомалните подединици ретко беа забележани во шемата на миграција на егзосомната РНК, што укажува на сигурна чистота (Слика 1C).Конечно, трансмисионата електронска микроскопија покажа дека набљудуваните егзосоми биле со големина од околу 60-150 nm и имале структура слична на чаша типична за морфологијата на егзозомите (сл. 1D).
Карактеризација на егзосомите добиени од BV2 клетките.(А) Страница за безбедносен лист.Протеините беа изолирани од BV2 клетки или егзозоми добиени од BV2.Обрасците на протеини се разликуваат помеѓу клетките и егзосомите.(Б) Вестерн блот анализа на егзозомски маркер (Alix).(В) Евалуација на прочистена РНК од BV2 клетки и BV2 добиени егзозоми со помош на биоанализатор.Така, 18S и 28S рибозомалните подединици во BV2 клетките ретко се наоѓаа во егзосомната РНК.(Г) Преносната електронска микроскопија покажа дека егзосомите изолирани од BV2 клетките биле негативно обоени со 2% уранил ацетат.Егзозомите се со големина од приближно 60-150 nm и во облик на чаша (Сонг и Јунг, необјавени податоци).
Клеточната интернализација на егзосомите добиени од BV2 во U87 човечки глиомски клетки беше забележана со помош на конфокална микроскопија.Егзозомите означени со PKH26 се локализирани во цитоплазмата на U87 клетките.Јадрата беа обоени со DAPI (сл. 2А), што покажува дека егзосомите добиени од BV2 може да се интернализираат од клетките домаќини и да влијаат на околината на клетките примачи.
Внатрешноста на егзосомите добиени од BV2 во U87 глиомските клетки и егзозомите добиени од BV2 инфицирани со Toxoplasma RH индуцирана пролиферација на U87 глиомските клетки.(А) Егзозоми проголтани од U87 клетки измерени со конфокална микроскопија.Клетките на глиомот U87 беа инкубирани со егзозоми означени со PKH26 (црвено) или без контрола 24 часа.Јадрата беа обоени со DAPI (сино) и потоа беа набљудувани под конфокален микроскоп (бар на скала: 10 μm, x 3000).(Б) У87 клеточната пролиферација на глиом беше одредена со анализа на клеточна пролиферација.Клетките на глиомот U87 беа третирани со егзозоми за наведеното време. *П < 0,05 е добиена со Студентски т тест. *П < 0,05 е добиена со Студентски т тест. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *P <0,05 од Студентскиот t-тест. *P <0,05 通过学生t 检验获得. *P <0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 добиени со помош на Студентскиот t-тест.
Откако ја потврдивме интернализацијата на егзосомите добиени од BV2 во клетките на глиомот U87, извршивме анализи за клеточна пролиферација за да ја истражиме улогата на егзосомите добиени од токсоплазма добиени од BV2 во развојот на клетките на човечкиот глиом.Третманот на U87 клетки со егзозоми од T. gondii-инфицирани BV2-клетки покажа дека егзозомите добиени од BV2 инфицирани со T. gondii предизвикаа значително поголема пролиферација на U87 клетките во споредба со контролната (сл. 2B).
Дополнително, растот на U118 клетките ги имаше истите резултати како U87, бидејќи егзосомите стимулирани од Токсоплазма предизвикаа највисоки нивоа на пролиферација (податоците не се прикажани).Врз основа на овие податоци, можеме да укажеме дека егзозомите инфицирани со Токсоплазма добиени од BV2 играат важна улога во пролиферацијата на глиомските клетки.
За да го истражиме ефектот на егзосомите добиени од BV2 инфицирани со токсоплазма врз развојот на туморот, инјектиравме U87 глиома клетки во голи глувци за модел на ксенографт и инјектиравме егзозоми добиени од BV2 или егзозоми добиени од BV2 инфицирани со RH.Откако туморите станаа очигледни по 1 недела, секоја експериментална група од 5 глувци беше поделена според големината на туморот за да се одреди истата почетна точка, а големината на туморот беше мерена 22 дена.
Кај глувците со моделот на ксенографт U87, значително поголема големина и тежина на туморот беа забележани во групата на егзосом инфицирани со RH добиени од BV2 на ден 22 (сл. 3А, Б).Од друга страна, немаше значајна разлика во големината на туморот помеѓу групата на егзосом добиени од BV2 и контролната група по третман со егзосом.Дополнително, глувците на кои им биле инјектирани глиомски клетки и егзозоми визуелно го прикажале најголемиот волумен на тумор во групата на RH-инфицирани егзозоми добиени од BV2 (сл. 3C).Овие резултати покажуваат дека егзозомите инфицирани со токсоплазма добиени од BV2 предизвикуваат раст на глиом кај модел на тумор на глувци.
Онкогенеза (AC) на егзозоми добиени од BV2 во модел на глувче со ксенографт U87.Големината на туморот (А) и тежината (Б) беа значително зголемени кај голи глувци BALB/c третирани со RH-инфицирани егзозоми добиени од BV2.BALB/c голи глувци (C) беа инјектирани субкутано со 1 x 107 U87 клетки суспендирани во смесата Matrigel.Шест дена по инјектирањето, 100 μg егзозоми добиени од BV2 беа третирани кај глувци.Големината и тежината на туморот беа измерени на наведените денови и по жртвувањето, соодветно. *P <0,05. *P <0,05. *Р < 0,05. *P <0,05. *P <0,05. *P <0,05. *Р < 0,05. *P <0,05.
Податоците покажаа дека 37 miRNAs (16 прекумерно изразени и 21 намалени) поврзани со имунитет или развој на тумор беа значително променети во микроглија по инфекцијата со сојот Toxoplasma RH (сл. 4А).Релативните нивоа на изразување на miR-21 меѓу изменетите miRNA беа потврдени со RT-PCR во реално време во егзосомите добиени од BV2, егзозоми третирани со BV2 и U87 клетки.Експресијата на miR-21 покажа значително зголемување на егзосомите од BV2 клетките инфицирани со Toxoplasma gondii (RH сој) (Сл. 4B).Релативните нивоа на изразување на miR-21 во BV2 и U87 клетките се зголемија по навлегувањето на променетите егзозоми (сл. 4B).Релативните нивоа на изразување miR-21 во мозочните ткива на пациенти со тумор и глувци инфицирани со Toxoplasma gondii (сој ME49) беа повисоки отколку кај контролите, соодветно (сл. 4C).Овие резултати се во корелација со разликите помеѓу нивоата на изразување на предвидените и потврдените микроРНК in vitro и in vivo.
Промени во изразот на егзозомски miP-21a-5p кај микроглија инфицирани со Toxoplasma gondii (RH).(А) Покажува значајни промени во siRNA поврзани со имунитет или развој на тумор по T. gondii RH инфекција.(Б) Релативните нивоа на изразување miR-21 беа откриени со RT-PCR во реално време во егзозоми добиени од BV2, егзозоми третирани со BV2 и U87 клетки.(В) Релативни нивоа на изразување на miR-21 беа пронајдени во мозочните ткива на пациенти со тумор (N=3) и глувци инфицирани со Toxoplasma gondii (сој ME49) (N=3). *П < 0,05 е добиена со Студентски т тест. *П < 0,05 е добиена со Студентски т тест. *P < 0,05 было получено со помош на t-критерия Стьюдента. *П < 0,05 е добиена со помош на Студент т-тест. *P <0,05 通过学生t 检验获得. *P <0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 добиени со помош на Студентскиот t-тест.
Егзозомите од RH-инфицирани BV2 клетки доведоа до раст на глиоми in vivo и in vitro (сл. 2, 3).За да ги откриеме релевантните мРНК, ги испитавме нивоата на мРНК на целните гени на мРНК, кутијата со вилушка О1 (FoxO1), PTEN и програмираната клеточна смрт 4 (PDCD4) во U87 клетките инфицирани со егзозоми добиени од BV2 или RH BV2.Биоинформатичката анализа покажа дека неколку гени поврзани со туморот, вклучувајќи ги гените FoxO1, PTEN и PDCD4, имаат места за врзување miR-2121,22.Нивоата на mRNA на антитуморните целни гени беа намалени во RH-инфицирани егзозоми добиени од BV2 во споредба со егзосомите добиени од BV2 (сл. 5А).FoxO1 покажа намалени нивоа на протеини во RH-инфицирани егзозоми добиени од BV2 во споредба со егзозомите добиени од BV2 (Слика 5Б).Врз основа на овие резултати, можеме да потврдиме дека егзосомите добиени од RH-инфициран BV2 ги намалуваат анти-онкогените гени, одржувајќи ја нивната улога во растот на туморот.
Егзосомите добиени од BV2 инфицирани со токсоплазма RH предизвикуваат супресија на антитуморните гени во U87 глиомските клетки од страна на егзозоми добиени од BV2 инфицирани со Toxoplasma RH.(А) ПЦР во реално време на експресијата на FoxO1, PTEN и PDCD4 во егзосомите добиени од T. gondii RH-инфициран BV2 во споредба со PBS егзосомите.Како контрола се користеше β-актин mRNA.(Б) Изразот на FoxO1 беше одреден со Western blotting и податоците од дензитометријата беа статистички оценети со помош на програмата ImageJ. *П < 0,05 е добиена со Студентски т тест. *П < 0,05 е добиена со Студентски т тест. *P < 0,05 было получено со помош на t-критерия Стьюдента. *П < 0,05 е добиена со помош на Студент т-тест. *P <0,05 通过学生t 检验获得. *P <0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 добиени со помош на Студентскиот t-тест.
За да се разбере ефектот на miP-21 во егзосомите врз регулацијата на генот поврзан со тумор, U87 клетките беа трансфектирани со инхибитор на miP-21 користејќи Lipofectamine 2000 и клетките беа собрани 24 часа по трансфекцијата.Нивоата на изразување на FoxO1 и p27 во клетките трансфицирани со miR-21 инхибитори беа споредени со клетки третирани со егзозоми добиени од BV2 користејќи qRT-PCR (сл. 6A,B).Трансфекцијата на miR-21 инхибиторот во U87 клетките значително го намали изразувањето на FoxO1 и p27 (СЛИКА 6).
RH-инфициран егзозомски BV2-изведен miP-21 ја промени експресијата на FoxO1/p27 во U87 глиомските клетки.Клетките U87 беа трансфектирани со миП-21 инхибитор користејќи Lipofectamine 2000 и клетките беа собрани 24 часа по трансфекцијата.Нивоата на изразување на FoxO1 и p27 во клетките трансфектирани со miR-21 инхибитори беа споредени со нивоата во клетките третирани со егзозоми добиени од BV2 користејќи qRT-PCR (A, B).
За да избега од имунолошкиот одговор на домаќинот, паразитот Toxoplasma се трансформира во ткивна циста.Тие паразитираат различни ткива, вклучувајќи го мозокот, срцето и скелетните мускули, во текот на целиот животен век на домаќинот и го модулираат имунолошкиот одговор на домаќинот.Покрај тоа, тие можат да го регулираат клеточниот циклус и апоптозата на клетките домаќини, промовирајќи ја нивната пролиферација14,24.Toxoplasma gondii претежно ги инфицира дендритичните клетки на домаќинот, неутрофилите и лозата на моноцити/макрофаги, вклучително и мозочната микроглија.Toxoplasma gondii индуцира диференцијација на макрофагите од фенотипот М2, влијае на заздравувањето на раните по инфекција со патогенот, а исто така е поврзана со хиперваскуларизација и грануломатозна фиброза.Оваа патогенеза на однесувањето на инфекцијата со токсоплазма може да биде поврзана со маркери поврзани со развојот на туморот.Непријателската средина регулирана со Toxoplasma може да личи на соодветниот преканцер.Затоа, може да се претпостави дека инфекцијата со токсоплазма треба да придонесе за развој на тумори на мозокот.Всушност, високи стапки на инфекција со токсоплазма се пријавени во серумот на пациенти со различни тумори на мозокот.Покрај тоа, Toxoplasma gondii може да биде уште еден канцероген ефектор и да делува синергетски за да им помогне на другите заразни канцерогени да развијат тумори на мозокот.Во овој поглед, вреди да се напомене дека P. falciparum и Epstein-Barr вирусот синергистички придонесуваат за формирање на Буркит-ов лимфом.
Улогата на егзосомите како регулатори во областа на истражувањето на ракот е опширно истражувана.Сепак, улогата на егзосомите помеѓу паразитите и заразените домаќини останува слабо разбрана.Досега, различни регулатори, вклучително и секретираните протеини, ги објаснија биолошките процеси со кои паразитите на протозои се спротивставуваат на нападот на домаќинот и ја продолжуваат инфекцијата.Неодамна, расте концептот дека микровезикулите поврзани со протозои и нивните микроРНК комуницираат со клетките домаќини за да создадат поволна средина за нивниот опстанок.Затоа, потребни се понатамошни студии за да се открие врската помеѓу изменетите егзозомски miRNA и пролиферацијата на глиомските клетки.Промената на микроРНК (групни гени miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 и miR-17-92) се врзува за STAT3 промоторот во човечки макрофаги инфицирани со токсоплазма, се регулира и индуцира анти -апоптоза како одговор на инфекција со Toxoplasma gondii 29 .Инфекцијата со токсоплазма ја зголемува експресијата на miR-17-5p и miR-106b-5p, кои се поврзани со неколку хиперпролиферативни болести 30 .Овие податоци сугерираат дека miRNA-те на домаќинот регулирани со инфекција со токсоплазма се важни молекули за преживување на паразитот и патогенезата во биолошкото однесување на домаќинот.
Променетите miRNA може да влијаат на различни типови на однесување за време на започнувањето и прогресијата на малигните клетки, вклучително и глиоми: самодоволност на сигналите за раст, нечувствителност на сигнали кои го инхибираат растот, избегнување на апоптоза, неограничен репликативен потенцијал, ангиогенеза, инвазија и метастази и воспаление.Кај глиомот, променетите miRNAs се идентификувани во неколку студии за профилирање на изразување.
Во оваа студија, потврдивме високи нивоа на изразување на miRNA-21 во клетките домаќини инфицирани со токсоплазма.miR-21 е идентификуван како една од најчесто преекспресираните микроРНК во цврсти тумори, вклучително и глиоми, 33 и неговата експресија е во корелација со степенот на глиом.Акумулирачките докази сугерираат дека miR-21 е нов онкоген кој делува како антиапоптотички фактор во растот на глиомот и е многу преекспресиран во ткивата и плазмата на малигнитет на човечкиот мозок.Интересно, инактивацијата на miR-21 во клетките и ткивата на глиомот предизвикува инхибиција на клеточната пролиферација поради апоптоза зависна од каспаза.Биоинформатската анализа на предвидените цели на miR-21 откри повеќекратни туморски супресорни гени поврзани со патеките на апоптоза, вклучително и програмирана клеточна смрт 4 (PDCD4), тропомиозин (TPM1), PTEN и кутија со вилушка O1 (FoxO1), со местото на врзување miR-2121..22.38.
FoxO1, како еден од факторите на транскрипција (FoxO), е вклучен во развојот на различни видови на човечки рак и може да ја регулира експресијата на гените за супресор на туморот, како што се p21, p27, Bim и FasL40.FoxO1 може да ги врзе и активира инхибиторите на клеточниот циклус како што е p27 за да го потисне растот на клетките.Покрај тоа, FoxO1 е клучен ефектор на сигнализацијата PI3K/Akt и регулира многу биолошки процеси како што се прогресијата на клеточниот циклус и клеточната диференцијација преку активирање на транскрипцијата на p2742.
Како заклучок, веруваме дека егзосомниот miR-21 добиен од микроглија инфицирани со токсоплазма може да игра важна улога како регулатор на растот на клетките на глиомот (сл. 7).Сепак, потребни се дополнителни студии за да се најде директна врска помеѓу егзозомниот miR-21, изменетата инфекција со токсоплазма и растот на глиомот.Овие резултати се очекува да обезбедат почетна точка за проучување на врската помеѓу инфекцијата со токсоплазма и инциденцата на глиом.
Шематски дијаграм на механизмот на карциногенезата на глиома (мозок) е предложен во оваа студија.Авторот црта во PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Сите експериментални протоколи во оваа студија, вклучително и употребата на животни, беа во согласност со Стандардните етички упатства за нега на животни и комитет за корисници на Националниот универзитет во Сеул и беа одобрени од Одборот за институционална ревизија на Медицинскиот факултет на Националниот универзитет во Сеул (IRB број SNU- 150715).-2).Сите експериментални процедури беа спроведени во согласност со препораките на ARRIVE.
БВ2 глувчешки микроглија и U87 човечки глиомски клетки беа култивирани во Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Welgene, Сеул, Кореја) и медиум на Roswell Park Memorial Institute (RPMI; Welgene), соодветно, секој содржеше 10% фетален говедски серум, 4 mMl глутамин, 0,2 mM пеницилин и 0,05 mM стрептомицин.Клетките беа култивирани во инкубатор со 5% CO2 на 37°C.Друга клеточна линија на глиом, U118, беше искористена за споредба со U87 клетките.
За да се изолираат егзосомите од соевите RH и ME49 инфицирани со T. gondii, T. gondii тахизоитите (RH сој) беа собрани од абдоминалната празнина на 6-неделни глувци BALB/c инјектирани 3-4 дена претходно.Тахизоитите беа измиени три пати со PBS и прочистени со центрифугирање во 40% Percoll (Sigma-Oldrich, St. Louis, MO, USA)43.За да се добијат тахизоити од сојот ME49, на глувците BALB/c им беа интраперитонеално инјектирани 20 ткивни цисти и трансформацијата на тахизоитот во цисти беше собрана со миење на абдоминалната празнина на 6-8-от ден по инфекцијата (PI).Глувци инфицирани со PBS.Тахизоитите ME49 беа одгледувани во клетки дополнети со 100 μg/ml пеницилин (Gibco/BRL, Grand Island, NY, САД), 100 μg/ml стрептомицин (Gibco/BRL) и 5% фетален говедски серум (Lonza, Walkersville, MD) .., САД) на 37 °C и 5% јаглерод диоксид.По одгледувањето во клетките на Веро, МЕ49 тахизоитите беа поминати двапати низ игла со мерач 25, а потоа преку филтер од 5 µm за да се отстранат остатоците и клетките.По миењето, тахизоитите беа повторно суспендирани во PBS44.Ткивните цисти на сојот ME49 на Toxoplasma gondii беа одржувани со интраперитонеална инјекција на цисти изолирани од мозокот на инфицирани C57BL/6 глувци (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Кореја).Мозоците на глувците инфицирани со ME49 беа собрани по 3 месеци PI и мелени под микроскоп за да се изолираат цистите.Заразените глувци биле чувани под посебни услови без патогени (SPF) на Медицинскиот факултет на Националниот универзитет во Сеул.
Вкупната РНК беше извлечена од егзосомите, BV2 клетките и ткивата добиени од BV2 со помош на мини комплетот miRNeasy (Qiagen, Hilden, Германија) според упатствата на производителот, вклучувајќи го и времето на инкубација за чекорот на елуција.Концентрацијата на РНК беше одредена на спектрофотометар NanoDrop 2000.Квалитетот на микросредите на РНК беше проценет со помош на биоанализатор Agilent 2100 (Agilent Technologies, Amstelveen, Холандија).
DMEM со 10% FBS сиромашни со егзосом беше подготвен со ултрацентрифугирање на 100.000 g за 16 часа на 4°C и се филтрира преку филтер од 0,22 µm (Nalgene, Rochester, NY, САД).Клетките BV2, 5 × 105, беа култивирани во DMEM што содржи 10% FBS осиромашено од егзосом и 1% антибиотици на 37°C и 5% CO2.По 24 часа од инкубацијата, тахизоитите од сојот RH или ME49 (MOI = 10) беа додадени во клетките и паразитите кои не беа инвазивни беа отстранети во рок од еден час и повторно наполнети со DMEM.Егзозомите од BV2 клетките беа изолирани со модифицирана диференцијална центрифугација, најшироко користен метод.Повторно суспендирајте го егзосомниот пелети во 300 µl PBS за анализа на РНК или протеини.Концентрацијата на изолираните егзозоми беше одредена со користење на комплет за анализа на BCA протеини (Pierce, Rockford, IL, USA) и спектрофотометар NanoDrop 2000.
Талогите од BV2 клетките или егзосомите добиени од BV2 беа лизирани во раствор за екстракција на протеин PRO-PREP™ (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Кореја) и протеините беа ставени на Coomassie брилијантно сино обоени 10% SDS полиакриламид гелови.Покрај тоа, протеините беа префрлени во PVDF мембраните за 2 часа.Western blots беа потврдени со користење на антителото Alix (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) како егзозомален маркер.Како секундарно антитело се користеше HRP-конјугиран коза против глушец IgG (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, САД) и LAS-1000 плус луминисцентен анализатор на слики (Fuji Photographic Film, Токио, Јапонија)..Беше изведена трансмисиона електронска микроскопија за проучување на големината и морфологијата на егзосомите.Егзозомите изолирани од BV2 клетките (6,40 µg/µl) беа подготвени на мрежи обложени со јаглерод и негативно обоени со 2% уранил ацетат за 1 мин.Подготвените примероци беа набљудувани на забрзувачки напон од 80 kV со помош на JEOL 1200-EX II (Токио, Јапонија) опремен со ES1000W Erlangshen CCD камера (Gatan, Pleasanton, CA, USA).
Егзозомите добиени од BV2 беа обоени со помош на комплетот за поврзување со црвени флуоресцентни PKH26 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 15 минути на собна температура.U87 клетките, 2×105, со PKH26-означени егзозоми (црвени) или без егзозоми како негативна контрола, беа инкубирани на 37°C 24 часа во 5% CO2 инкубатор.Јадрата на U87 клетки беа обоени со DAPI (сина), U87 клетките беа фиксирани во 4% параформалдехид за 15 мин на 4°C и потоа анализирани во Leica TCS SP8 STED CW систем конфокален микроскоп (Leica Microsystems, Mannheim, Германија).забележлив.
cDNA беше синтетизирана од siRNA со користење на синтеза на првата нишка на Mir-X siRNA и комплет SYBR qRT-PCR (Takara Bio Inc., Shiga, Јапонија).Во реално време, квантитативната PCR беше изведена со користење на системот за детекција на PCR во реално време iQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) со користење на прајмери ​​и шаблони измешани со SYBR Premix.ДНК беше засилена за 40 циклуси на денатурација на 95°C за 15 секунди и жарење на 60°C за 60 секунди.Податоците од секоја PCR реакција беа анализирани со помош на модулот за анализа на податоци на софтверот на оптичкиот систем iQ™5 (Bio-Rad).Релативните промени во генската експресија помеѓу избраните целни гени и β-актин/siRNA (и U6) беа пресметани со користење на методот на стандардна крива.Користените прајмери ​​секвенци се прикажани во Табела 1.
3 x 104 U87 клетки на глиом беа засеани во плочи со 96 бунари и измешани со егзозоми инфицирани со Токсоплазма добиени од BV2 (50 μg/mL) или непулсни егзозоми добиени од BV2 (50 μg/mL) како контроли на 12, 18 и 36 часа. .Стапката на пролиферација на клетките беше одредена со помош на комплетот за броење клетки-8 (Доџиндо, Кумамото, Јапонија) (Дополнителни слики S1-S3) 46 .
Голи глувци BALB/c стари 5 недели беа купени од Orient Bio (Seongnam-si, Јужна Кореја) и беа чувани поединечно во стерилни кафези на собна температура (22±2°C) и влажност (45±15°C).%) на собна температура (22±2°C) и влажност (45±15%).12-часовен циклус на светлина и 12-часовен циклус на темнина беа изведени под SPF (Животински центар за медицинско училиште за национален универзитет во Сеул).Глувците беа случајно поделени во три групи од по 5 глувци и на сите групи беа инјектирани субкутано со 400 ml PBS што содржи 1 x 107 U87 глиомски клетки и намален фактор на раст BD Matrigel™ (BD Science, Miami, FL, USA).Шест дена по вбризгувањето на туморот, 200 mg егзозоми добиени од BV2 клетки (со/без инфекција со токсоплазма) беа инјектирани во местото на туморот.Дваесет и два дена по инфекцијата на туморот, големината на туморот на глувците во секоја група беше мерена со дебеломер три пати неделно, а волуменот на туморот беше пресметан со формулата: 0,5×(ширина)×2×должина.
Анализа на изразување на микроРНК со помош на miRCURYTM LNA miRNA низа, 7-та генерација има, mmu и rno низи (EXIQON, Vedbaek, Данска) што опфаќа 1119 добро карактеризирани глувци меѓу 3100 сонди за фаќање миРНК од луѓе, глувци и стаорци.За време на оваа постапка, 250 до 1000 ng од вкупната РНК беа отстранети од 5'-фосфатот со третман со цревна алкална фосфатаза од теле проследено со означување со Hy3 зелена флуоресцентна боја.Обележаните примероци потоа беа хибридизирани со вчитување на слајдови со микросреди користејќи комплет за комора за хибридизација (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) и комплет за слајдови за хибридизација (Agilent Technologies).Хибридизацијата се вршеше 16 часа на 56°C, а потоа микросредите беа измиени во согласност со препораките на производителот.Обработените слајдови со микросреди потоа беа скенирани со помош на Agilent G2565CA скенер систем за микросреди (Agilent Technologies).Скенираните слики беа увезени со користење на софтверот Agilent Feature Extraction верзија 10.7.3.1 (Agilent Technologies) и интензитетот на флуоресценција на секоја слика беше квантифициран со користење на соодветната GAL-датотека од изменетиот протокол Exiqon.Податоците од микросреди за тековната студија се депонирани во базата на GEO под пристапниот број GPL32397.
Профилите на изразување на зрели егзозомски miRNA во микроглија на соеви RH или ME49 инфицирани со Toxoplasma беа анализирани со користење на различни мрежни алатки.МиРНК поврзани со развојот на туморот беа идентификувани со помош на miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) и филтрирани со нормализиран интензитет на сигналот (log2) поголем од 8,0.Помеѓу miRNAs, беше откриено дека диференцијално изразените miRNAs се повеќе од 1,5 пати изменети со филтер анализа на miRNAs изменети од соеви RH или ME49 инфицирани со T. gondii.
Клетките беа засеани во чинии со шест бунари (3 x 105 клетки/бунар) во opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, USA) користејќи Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).Трансфицираните клетки беа култивирани 6 часа, а потоа медиумот беше сменет во свеж целосен медиум.Клетките беа собрани 24 часа по трансфекцијата.
Статистичката анализа главно се вршеше со користење на Студентски т-тест со софтвер Excel (Мајкрософт, Вашингтон, ДЦ, САД).За анализа на експериментални животни, беше изведена двонасочна ANOVA со користење на софтверот Prism 3.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). P-вредностите < 0,05 се сметаа за статистички значајни. P-вредностите < 0,05 се сметаа за статистички значајни. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P вредностите <0,05 се сметаа за статистички значајни. P 值< 0,05 被认为具有统计学意义. P 值< 0,05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P вредностите <0,05 се сметаа за статистички значајни.
Сите експериментални протоколи користени во оваа студија беа одобрени од Одборот за институционален преглед на Медицинскиот факултет на Националниот универзитет во Сеул (IRB број SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. et al.Проценета глобална инциденца и смртност од рак во 2018 година: извори и методи на ГЛОБОКАН.Толкување.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Рашид, С., Реман, К. и Акаш, МС Увид во факторите на ризик од тумори на мозокот и нивните терапевтски интервенции. Рашид, С., Реман, К. и Акаш, МС Увид во факторите на ризик од тумори на мозокот и нивните терапевтски интервенции.Рашид, С., Реман, К. и Акаш, МС Преглед на факторите на ризик за тумори на мозокот и големи терапевтски интервенции. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施。 Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Длабоко разбирање на факторите на ризик од тумор на мозокот и терапевтски интервенции.Рашид, С., Реман, К. и Акаш, МС Преглед на факторите на ризик за тумори на мозокот и големи терапевтски интервенции.Биомедицинска наука.Фармацевт.143, 112119 (2021).
Като, И., Жанг, Ј. и Сан, Ј. Като, И., Жанг, Ј. и Сан, Ј.Kato I., Zhang J. и Sun J. Бактериско-вирусни интеракции кај ракот на човечкиот гастроинтестинален тракт и женскиот генитален тракт: резиме на епидемиолошки и лабораториски податоци. Като, И., Жанг, Џ. и Сан, Џ.据总结. Като, И., Жанг, Ј.Като И., Џанг Ј. и Сун Ј. Бактериско-вирусни интеракции кај човечкиот гастроинтестинален рак и женскиот генитален карцином: резиме на епидемиолошки и лабораториски податоци.Рак 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL Од инфекција до рак: Како ДНК туморските вируси го менуваат централниот јаглерод и липидниот метаболизам на клетката домаќин. Magon, KL & Parish, JL Од инфекција до рак: Како ДНК туморските вируси го менуваат централниот јаглерод и липидниот метаболизам на клетката домаќин.Mahon, KL и Parish, JL Огнена инфекција со рак: како туморските вируси базирани на ДНК го менуваат централниот јаглерод и липидниот метаболизам на клетката домаќин. Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：DNA 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质代谢 Magon, KL & Parish, JL Од инфекција до рак: како ДНК туморските вируси го менуваат централниот јаглерод и липидниот метаболизам на клетката домаќин.Махон, КЛ и Париш, Џ.Л. Ја пренесува инфекцијата до рак: како ДНК туморските вируси го менуваат централниот јаглерод и липидниот метаболизам во клетките домаќини.Отворена биологија.11, 210004 (2021).
Кореја да Коста, ЈМ и сор.Катехолни естрогени на шистозоми и метили на црниот дроб и рак поврзан со хелминти.напред.жешко внатре.5, 444 (2014).